Summary

Génération indépendante et dépendante de la sélection de CRISPR / Cas9-Meded Knockouts dans les cellules de mammifères

Published: June 16, 2017
doi:

Summary

Les progrès récents dans la capacité de manipuler génétiquement les lignées cellulaires somatiques offrent un grand potentiel pour la recherche fondamentale et appliquée. Ici, nous présentons deux approches pour la production et le dépistage de knock-out créés par CRISPR / Cas9 dans des lignées cellulaires de mammifères, avec et sans utilisation de marqueurs sélectionnables.

Abstract

Le système d'ingénierie du génome CRISPR / Cas9 a révolutionné la biologie en permettant un montage précis du génome avec peu d'effort. Guidé par un seul ARN guide (sgRNA) qui confère une spécificité, la protéine Cas9 clive les deux brins d'ADN au locus ciblé. La rupture de l'ADN peut déclencher une jointure terminale non homologue (NHEJ) ou une réparation dirigée par homologie (HDR). NHEJ peut introduire de petites suppressions ou des insertions qui conduisent à des mutations par déplacement de trame, tandis que HDR permet des perturbations plus grandes et plus précises. Ici, nous présentons des protocoles pour générer des lignées cellulaires knock-out en couplant les méthodes CRISPR / Cas9 établies avec deux options pour la sélection / sélection en aval. L'approche NHEJ utilise un seul site de coupe de sgRNA et un dépistage indépendant de la sélection, où la production de protéines est évaluée par immunotransfert par points de manière à haut débit. L'approche HDR utilise deux sites de sgRNA coupés qui couvrent le gène d'intérêt. Ensemble avec un modèle HDR fourni, cette méthode peut éliminerDe dizaines de kb, aidé par le marqueur de résistance sélectionnable inséré. Les applications et avantages appropriés de chaque méthode sont discutés.

Introduction

Les modifications génétiques stables offrent un avantage sur les méthodes transitoires de perturbation cellulaire, qui peuvent être variables dans leur efficacité et leur durée. L'édition génomique est devenue de plus en plus courante ces dernières années en raison du développement de nucléases spécifiques cibles, telles que les nucléases 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , les nucléases effectrices de l'activateur de la transcription (TALEN) 6 , 7 , 8 , 9 Et des nucléases guidées par l'ARN dérivées du système de répétitions palindromiques courtes (CRISPR) regroupées, régulièrement intercalées 10 .

La machine d'édition CRISPR / Cas9 est adaptée d'un système immunitaire que les bactéries et les archées utilisent pour se défendre contre les infections viralesAss = "xref"> 11 , 12 , 13 . Dans ce processus, des fragments courts de 20-30 nt de séquence virale envahissante sont incorporés dans un locus génomique comme des "entretoises" flanqués par des unités répétitives 14 , 15 . La transcription subséquente et le traitement de l'ARN génèrent de petits ARN 16 associés à CRISPR (crRNAs) qui, conjointement avec un CRRNA 17 trans-activant (tracrRNA), assemblent avec l'endonucléase Eff9 Cas9. Les crRNAs fournissent donc une spécificité au ciblage Cas9, guidant le complexe pour cliver des séquences d'ADN virales complémentaires et prévenir d'autres infections 18 , 19 . Toute séquence "protospacer" dans l'ADN ciblé peut servir de source de l'ARNrm, pourvu qu'elle soit directement à 5 'd'un motif adjacent de protospacer court (PAM), NGG dans le cas de S. pyogenes Cas9 <sUp class = "xref"> 20. L'absence de la séquence PAM près de l'espaceur dans le locus CRISPR de l'hôte se distingue entre soi-même et non-soi, empêchant le ciblage de l'hôte. En raison de son universalité et de sa flexibilité, ce système biologique a été puissamment adapté pour l'édition génomique, de telle sorte que presque n'importe quel site d'ADN adjacente au PAM peut être ciblé. Dans cette version, une autre modification a fusionné le crRNA et l'ARNt de trac en un seul composant guide RNA (sgRNA) qui est chargé dans la protéine Cas9 21 .

Lors de l'expression de Cas9 et d'un sgRNA dans des cellules eucaryotes, la protéine Cas9 clive les deux brins d'ADN au locus ciblé. En l'absence d'une région appropriée de séquence homologue, la cellule corrige cette rupture par l'intermédiaire d'une jointure finale non homologue (NHEJ) 22 , 23 , 24 , qui introduit typiquement de petites deletions ou, rarement, des insertions. Lorsque vous ciblez unCadre de lecture, la réparation entraîne probablement un changement de cadre translationnel qui produit un produit protéique non fonctionnel. En revanche, lorsqu'elle est munie d'un modèle exogène avec de grandes régions d'homologie, la cellule peut réparer la rupture à double brin par une réparation dirigée par homologie 25 , 26 . Cette voie permet des deletions, des remplacements ou des insertions plus importantes dans le génome, associées à l'introduction de marqueurs de sélection excisables 27 .

Ici, nous présentons des protocoles pour générer des lignées cellulaires knock-out par l'une ou l'autre de ces deux méthodes CRISPR / Cas9 ( Figure 1A ). L'approche NHEJ utilise un seul site de coupe de sgRNA et un dépistage indépendant de la sélection, et nécessite donc une préparation précieuse. Lors de l'utilisation de cette méthode, il convient de concevoir des ARN de guide complémentaires aux exons près de la fin de la transcription 5 ', qui sont les plus susceptibles de produire un knock-out. Depuis le modificatLes ions du génome dans ce cas sont petits, le dépistage des clones knock-out est basé sur des transferts de points, où le produit protéique est évalué à haut débit. Nous utilisons par exemple la génération de liaisons knock-out ELAV-like 1 (ELAVL1). La deuxième approche repose sur la réparation dirigée par homologie (HDR) et utilise deux sites de sgRNA coupés qui couvrent le gène ou la région d'intérêt, ce qui permet de supprimer des dizaines de kb. Un plasmide avec deux régions d'homologie qui flanquent les sites de clivage fournit un modèle de remplacement ( Figure 1B ), en introduisant un marqueur de résistance sélectionnable qui augmente l'efficacité de la génération de knock-out. Cette méthode peut également être adaptée pour introduire des modifications de gènes avec des bras d'homologie correctement conçus. Dans ce cas, l'intégration d'un nouveau fragment d'ADN permet un dépistage par PCR ( Figure 1C ). Ici, nous utilisons la génération des lignes knock-out 2 de la famille de liaison Pumilio RNA (PUM2) à titre d'exemple.

Protocol

1. Identification des régions d'homologie autour de la suppression désirée REMARQUE: nécessaire uniquement si vous utilisez l'édition basée sur la sélection. Sélectionnez deux régions, initialement 1,5-2 kb, de chaque côté du locus de suppression désiré, qui serviront d'armes d'homologie dans le modèle HDR ( Figure 1A ). Identifiez les régions qui manquent de sites de reconnaissance BsaI sur l'un ou l'autre des d…

Representative Results

Pour la génération de lignes knock-out ELAVL1, un anticorps robuste était disponible, de sorte que l'édition utilisant des sgRNAs simples ( Figure 1A , à gauche) a été effectuée, suivie d'un immunoblot point. Trois sgRNAs ont été transfectés de manière indépendante pour comparer l'efficacité et éliminer les effets cibles dans les clones résultants. Après avoir recueilli et bloqué les lysats cellulaires à partir de populations c…

Discussion

Le système CRISPR / Cas9 a permis une génération efficace de modifications génomiques stables, qui fournissent une alternative plus cohérente aux autres méthodes de manipulation transitoires. Ici, nous avons présenté deux méthodes pour l'identification rapide des knockouts du gène CRISPR / Cas9 dans les lignées cellulaires de mammifères. Les deux méthodes nécessitent peu de matériel cellulaire, de sorte que les tests peuvent être effectués dans les premiers stades de la culture clonale, en économis…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs souhaitent remercier Gissell Sanchez, Megan Lee et Jason Estep pour l'aide expérimentale, et Weifeng Gu et Xuemei Chen pour le partage des réactifs.

Materials

Competent E. coli cells
plasmid prep kit
pSpCas9(BB) plasmid Addgene 42230 Ran et al 2013, cloning sgRNAs
BbsI enzyme ThermoFisher FD1014 Ran et al 2013, cloning sgRNAs
T7 DNA ligase NEB M0318L Ran et al 2013, cloning sgRNAs
Tango Buffer ThermoFisher BY5 Ran et al 2013, cloning sgRNAs
PlasmidSafe exonuclease Epicentre E3105K Ran et al 2013, cloning sgRNAs
Q5 hot start high fidelity polymerase NEB M0494A HA amplification
pUC19-BsaI Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion
pGolden-Neo Addgene 51422 Resistance cassette
pGolden-Hygro Addgene 51423 Resistance cassette
BsaI enzyme NEB R3535S Homology arm contruction
T7 DNA ligase NEB M0318L
PlasmidSafe exonuclease Epicentre E3105K
Toothpicks bacterial PCR
Taq polymerase bacterial colony PCR
HEK293 human cells
DMEM Corning 10-013-CV
FBS Corning MT35010CV
Penicillin-Strep (opt.) Gibco 15140-122
6 well plates BioLite 12556004
TransIT-LTI Transfection Reagent Mirus MIR2300 for lipofection only
Opti-MEM ThermoFisher 31985062 for lipofection only
G418 (Neomycin) Sigma Aldrich A1720-5G
Hygromycin Sigma Aldrich H3274-250MG
96 well plates ThermoFisher 12556008
Passive Lysis Buffer, 5x Promega
1xSDS loading buffer recipe decribed in protocol
Nitrocellulose Membrane Bio-Rad 162-0115
TBST recipe decribed in protocol
Dehydrated milk
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ThermoFisher 34075 for HRP-conjugated secondary antibodies
Extracta DNA prep for PCR Quantabio 95091-025
KOD polymerase Novagen 71316

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Cite This Article
Sternburg, E. L., Dias, K. C., Karginov, F. V. Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (124), e55903, doi:10.3791/55903 (2017).

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