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神经科学

Endocitosi delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni ippocampali di misura

Published: September 04, 2017
doi:
10.3791/55862
, ,
1National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 2College of Pharmacy,Chung-ang University

Summary

Endocitosi delle vescicole sinaptiche sono rilevato da microscopia chiara di pHluorin fuso con proteine delle vescicole sinaptiche e da microscopia elettronica dell’assorbimento della vescicola.

Abstract

Durante endocitosi, fusione delle vescicole sinaptiche sono Estratto alle terminazioni nervose, permettendo per riciclo delle vescicole e quindi il mantenimento della trasmissione sinaptica durante la cottura ripetuto del nervo. Alterata endocitosi in condizioni patologiche conduce alle diminuzioni in funzioni sinaptiche di forza e cervello. Qui, descriviamo i metodi utilizzati per misurare la endocitosi delle vescicole sinaptiche alla sinapsi ippocampo mammifera in coltura neuronale. Abbiamo monitorato endocitosi proteine delle vescicole sinaptiche fondendo una proteina di membrana vescicolare sinaptica, compreso lo synaptophysin e VAMP2/sinaptobrevina, sul lato di lumenal vescicolare, con pHluorin, una proteina fluorescente verde di pH sensibili che aumenta la sua aumenta l’intensità di fluorescenza come il pH. Durante l’esocitosi, vescicolare lumen pH aumenta, mentre durante il lume vescicolare endocitosi pH è ri-acidificato. Così, un aumento dell’intensità di fluorescenza pHluorin indica fusione, mentre una diminuzione indica endocitosi della proteina marcata delle vescicole sinaptiche. Oltre a utilizzare il metodo di imaging pHluorin per registrare endocitosi, abbiamo monitorato endocitosi membrana vescicolare da misure di microscopia elettronica (EM) del rafano perossidasi (HRP) assorbimento dalle vescicole. Infine, abbiamo monitorato la formazione dei pozzi di membrana terminale del nervo in tempi diversi dopo la depolarizzazione indotta da potassio alta. Il corso di formazione di pozzo di assorbimento e membrana HRP tempo indica il corso di tempo dell’endocitosi.

Introduction

Neurotrasmettitori sono memorizzati in vescicole sinaptiche e distribuiti dalla esocitosi. La membrana della vescicola sinaptica e la proteina sono quindi interiorizzati dal endocytosis e riutilizzati nel prossimo turno di esocitosi. Endocitosi delle vescicole sinaptiche sono importante per il mantenimento piscine delle vescicole sinaptiche e rimuove vescicole sporgente dalla membrana plasmatica. PHluorin la proteina fluorescente verde sensibili al pH, che è spenta in circostanze acide e dequenched a pH neutro, è stato utilizzato per misurare il tempo di endocitosi corsi in diretta le cellule1,2,3. La proteina di pHluorin è in genere associata al lato lumenal di proteine delle vescicole sinaptiche, come lo synaptophysin o VAMP2/sinaptobrevina. A riposo, pHluorin è spenta in lumen pH 5,5 delle vescicole sinaptiche. Fusione della vescicola alla membrana plasmatica espone il lume vescicolare alla soluzione extracellulare dove il pH è ~ 7.3, conseguente aumento nella fluorescenza pHluorin. Dopo l’esocitosi, l’aumento della fluorescenza decade, a causa di endocitosi delle proteine delle vescicole sinaptiche, seguita da ri-acidificazione vescicola all’interno di tali vescicole recuperate. Anche se il decadimento riflette sia endocitosi e ri-acidificazione vescicolare, essa riflette principalmente endocitosi, perché ri-acidificazione è più veloce di endocitosi nella maggior parte delle condizioni1,4. La costante di tempo di ri-acidificazione è 3-4 s o meno5,6, che è generalmente più veloce di 10 s o superiore richiesto per endocitosi delle vescicole4,5. Se sono necessari esperimenti per distinguere endocitosi da ri-acidificazione, acidi dissetante esperimenti utilizzando la soluzione di (MES) acida 4-Morpholineethanesulfonic (25 mM) con un pH di 5.5 possono essere utilizzati per determinare se vengono recuperate proteine delle vescicole sinaptiche dalla membrana del plasma tramite endocitosi1,3,4. Così, l’aumento di intensità di fluorescenza pHluorin riflette un equilibrio di exo – ed endocitosi e la diminuzione dopo stimolazione del nervo in particolare riflette endocitosi.

pHluorin formazione immagine può essere usata non solo per misurare il corso di tempo dell’endocitosi, ma anche la dimensione della vescicola sinaptica piscine7,8, e la probabilità di rilascio evocato e spontaneo versione9. Molti fattori e proteine coinvolte nella regolazione di endocitosi, quali calcio, le proteine solubili NSF-attachment proteina recettore (rullante), factor(BDNF) neurotrophic cervello-derivato e della calcineurina sono stati identificati usando pHluorin imaging1 , 2 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16. Inoltre, il rilascio di neurotrasmettitore potrebbe essere rilevata nei neuroni non solo primari ma in cellule di neuroblastoma con TIRFM17. Recentemente, pHTomato, dsRed, mOrange e varianti di pHluorin sono stati sviluppati per il monitoraggio di registrazioni simultanee di fattori multipli in una singola sinapsi18,19. Ad esempio, pHTomato è stato fuso con lo synaptophysin e utilizzato con un indicatore di calcio codificato geneticamente (GCaMP5K) per monitorare la fusione della vescicola presinaptica e afflusso di Ca2 + nel compartimento postsinaptico20. Di conseguenza, pHluorin associata a proteine sinaptiche fornisce un metodo utile per analizzare la relazione fra endocitosi ed esocitosi.

EM è un altro metodo comunemente usato per lo studio di endocitosi, grazie all’elevata risoluzione spaziale che mostra i cambiamenti ultrastrutturali durante endocitosi. Due aree generali sono la capacità di visualizzare cambiamenti patologici all’interno di cellule neuronali21 e tenere traccia della vescicola proteine22. In particolare, l’osservazione dell’assorbimento delle vescicole sinaptiche, curvatura di membrana rivestite di clatrina nella zona periattiva ed endosomal strutture sono possibili con EM3,23,24,25 ,26,27,28. Mentre EM comporta potenziali artefatti, come fissativo-indotto malformazioni, che possono pregiudicare la endocitosi, e analisi dei dati è laboriosa, che la risoluzione fornisce un’opportunità interessante per visualizzare la struttura cellulare. Potenziali problemi di fissativo e la limitazione a risoluzione temporale EM può essere superati da alta pressione congelamento, fornendo un metodo veloce e non chimici di stabilizzare le delicate strutture presenti durante endocitosi27.

Protocol

Nota: il seguente protocollo descrive i metodi di formazione immagine di pHluorin e metodi EM utilizzati in neuroni hippocampal coltivati. pHluorin monitor delle vescicole sinaptiche proteine l’assorbimento nelle cellule viventi ed EM rileva l’assorbimento delle vescicole sinaptiche e cambiamenti ultrastrutturali. cura degli animali e procedura seguite linee guida NIH e sono stati approvati dal comitato di uso e cura degli animali NIH. 1. pHluorin Imaging <…

Representative Results

Utilizzando il metodo di elemento portante del lipido, SpH è stato espresso nei neuroni dell’ippocampo, che consenta l’identificazione dei boutons (Figura 1a). La stimolazione elettrica delle cellule indotto esocitosi e un corrispondente aumento in intensità di fluorescenza. L’aumento della fluorescenza (ΔF) è stato interrotto terminando lo stimolo (Figura 1b). L’aumento della fluorescenza è stata seguita da una lenta diminu…

Discussion

Qui dimostriamo due metodi per il monitoraggio di endocitosi delle vescicole sinaptiche. Nel primo metodo, abbiamo monitorato pHluorin fuse con una proteina della vescicola sinaptica nei neuroni trasfettati e successivamente elettricamente stimolata. In secondo luogo, abbiamo usato la formazione immagine EM dell’assorbimento HRP come indotto da KCl. Abbiamo usato diversi stimoli per due motivi. In primo luogo, applicazione di potassio induce la depolarizzazione di tutti i neuroni nella cultura. Questo facilita l’esame EM…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo il Dr. Yong-Ling Zhu per fornire lo synaptophysin-pHluorin2x costrutto e Dr. James E. Rothman per fornire VAMP2-phluorin. Ringraziamo Dr. Susan Cheng e Virginia Crocker di NINDS microscopia elettronica Facility per loro guida e supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato dall’Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo programma di ricerca intramurale in USA e una sovvenzione dal programma iniziativa ricerca KRIBB (coreano Biomedical Scientist Fellowship Program), Korea Research Institute di Bioscienze e biotecnologie, Repubblica di Corea.

Materials

Lipofectamine LTX with Plus Thermo Fisher 15338-100 Transfection of plasmid DNA including synaptophysin or VAMP2-pHluorin
neurobasal medium Thermo Fisher 21103-049 Growth medium for neuron, Warm up to 37°C before use
B27 Thermo Fisher 17504-044 Gradient for neuronal differentiation
Glutamax Thermo Fisher 35050-061 Gradient for neuronal culture
Poly-D-Lysine coated coverslip Neuvitro GG-25-pdl Substrate for neuronal growth and imaging of pHluorin
Trypsin XI from bovine pancrease Sigma T1005 Neuronal culture-digest hippocampal tissues
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma D5025 Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension
pulse stimulator A-M systems model 2100 Apply electrical stimulation
Slotted bath with field stimulation Warner Instruments RC-21BRFS Apply electrical stimulation
stimulus isolation unit Warner Instruments SIU102 Apply electrical stimulation
lubricant Dow corning 111 pHluorin imaging-seal with coverslip and imaging chamber, avoid leak from chamber
AP5 Tocris 3693 Gradient for normal saline, selective NMDA receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity
CNQX Tocris 190 Gradient for normal saline, competitive AMPA/kainate receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity
Illuminator Nikon C-HGFI Metal halide light source for pHluorin
EMCCD camera Andor iXon3 pHluorin imaging, detect pHluorin fluorescence intensity
Inverted microscopy Nikon Ti-E Imaging for synaptophysin or VAMP2 pHluorin transfected cells
NIS-Elements AR Nikon NIS-Elements Advanced Research Software for imaging acquisition and analysis
Igor Pro WaveMetrics Igor pro Software for imaging analysis and data presentation
imaging chamber Warner Instruments RC21B pHluorin imaging, apply field stimulation on living cells
poly-l-lysine Sigma P4832 Electron microscopy, substrate for neuronal growth, apply on multiwell plate for 1 h at room temperature then wash with sterilized water 3 times
Horseradish peroxidase(HRP) Sigma P6782 Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by catalyzing DAB in presence hydrogen peroxide, final concentration is 5 mg/mL in normal saline, make fresh before use
Na cacodylate Electron Microscopy Sciences 12300 Electron microscopy, buffer for fixatives and washing, final concentration is 0.1 N
3,3′-Diaminobenzidine(DAB) Sigma D8001 Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles, substrate for HRP, final concentration is 0.5 mg/mL in DDW and filtered, make fresh before use
Hydrogen peroxide solution Sigma H1009 Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by inducing HRP-DAB reaction, final concentration is 0.3% in DDW, make fresh before use
glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences 16365 Electron microscopy, fixatives, final concentration is 4% in Na-cacodylate buffer, make fresh before use, shake well before to use
TEM JEOL 200CX Electron microscopy, imaging of endocytosed vesicles and ultrastructural changes
CCD digital camera AMT XR-100 Electron microscopy, capturing images
Lead citrate Leica microsystems 16707235 Electron microscopy, grid staining
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References

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Villarreal, S., Lee, S. H., Wu, L. Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (127), e55862, doi:10.3791/55862 (2017).
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