Isolamento e cultura de neurônios da medula espinhal de ratos neonatais
Summary
Este estudo apresenta uma técnica para o isolamento de neurônios de ratos neonatais WT. Requer a dissecção cuidadosa da medula espinhal do rato neonatal, seguida da separação de neurônios do tecido da medula espinhal através da clivagem mecânica e enzimática.
Abstract
Apresentamos um protocolo para o isolamento e a cultura dos neurônios da medula espinhal. Os neurônios são obtidos a partir de camundongos C57BL / 6 neonatais e são isolados no dia 1 pós-natal. Uma maca de rato, geralmente 4-10 cachorros nascidos de um par reprodutor, é recolhida para uma experiência e as cordas espinhais são coletadas individualmente de cada mouse após a eutanásia com isoflurano. A coluna vertebral é dissecada e depois a medula espinal é liberada da coluna. As cordas espinhais são então picadas para aumentar a área superficial de parto para uma protease enzimática que permite que os neurônios e outras células sejam liberados do tecido. A trituração é então usada para liberar as células em solução. Esta solução é subsequentemente fraccionada em um gradiente de densidade para separar as várias células em solução, permitindo que os neurônios sejam isolados. Aproximadamente 1-2,5 x 10 6 neurônios podem ser isolados de um grupo de lixo. Os neurônios são então semeados em poços revestidos com adesãoRs que permitem um crescimento e maturação adequados. Os neurônios levam aproximadamente 7 dias para atingir a maturidade no meio de crescimento e cultura e podem ser usados posteriormente para tratamento e análise.
Introduction
Compreender a patologia da medula espinhal requer o uso de vários modelos, tanto no nível macroscópico quanto microscópico. Os modelos de animais grandes e pequenos 1 , 2 , 3 são utilizados para investigações in vivo de doenças da medula espinhal e lesões. Ao estudar estas questões in vivo tem seus méritos, a análise da medula espinhal é limitada ao homogeneizado da medula espinal inteira ou às seções de tecido 4 . Isso cria alguma ambigüidade ao tentar isolar respostas e alvos específicos na medula espinhal entre seus neurônios residentes e glia circundante. A crescente disponibilidade de camundongos manipulados geneticamente permite investigações mais detalhadas da biologia em níveis celulares e moleculares. Assim, um modelo de rato neonatal é usado aqui, permitindo o estudo das propriedades únicas e biologia dos neurônios da medula espinhal in vitro .
O isolamento e manutenção de neurônios in vitro não é particularmente direto. Existe uma abundância relativa de técnicas de isolamento de neurônios do tecido cortical de roedores adultos que parecem resultar em um número substancial de neurônios isolados ( ou seja, milhões) 5 , 6 , 7. Em contraste, o rendimento de neurônios do tecido da medula espinhal é menor 8 , 9 , 10 , em parte devido à menor massa de tecido. Além disso, em camundongos, há uma escassez relativa de técnicas para o isolamento de neonatologia Os neurônios da medula espinhal e os métodos existentes são limitados por menores rendimentos de neurônios ( ou seja, centenas) 9 ou técnicas pesadas e pesadas que exigem o isolamento de camundongos embrionários 10 .Neste protocolo, nósUse uma técnica que permita o isolamento efetivo de custo e recursos de um número substancial de neurônios das cordas espinhais de camundongos neonatais. Como é comum em técnicas previamente publicadas, utilizamos papaina como protease enzimática, permitindo a liberação de neurônios do tecido da medula espinhal 5 , 6 . Além disso, usamos um gradiente de densidade para a separação de células refinadas, que anteriormente foi mostrado como efetivo 6 , 10 . Embora o meio em que as células estejam incubadas possa variar, em nossa experiência e como publicado anteriormente 11 , a suplementação com suplemento de meio de cultura B27 fresco provou ser crítica para a longevidade do neurônio. Os neurônios são geralmente viáveis por até 10 dias, permitindo que o tratamento seja realizado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esta técnica permite a cultura confiável dos neurônios da medula espinhal. Uma vez alcançada a proficiência na técnica, demora cerca de 3,5 h para completar. Nós conseguimos realizar o isolamento de neurônios de 2 camadas separadas (16 camundongos totais) em aproximadamente 4 h. O passo-chave na viabilidade é poder extrair com eficiência as cordas espinhais dos ratos. O rendimento permite revestir vários poços e a capacidade de testar os neurônios em várias condições. Nós conseguimos tratar os neurônio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores não têm reconhecimento.
Materials
| Hibernate A Medium – 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| Hibernate A Minus Calcium – 500 mL | Brainbits | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
| Glutamax 100X – 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
| B27 Supplement 50X – 10 mL | Thermo-Fisher | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
| Papain, Lyophilized – 100 mg | Worthington | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
| Neurobasal A Medium – 500 mL | Thermo-Fisher | 10888022 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Poly-D-lysine hydrobromide – 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
| Mouse Laminin – 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| Trypan Blue – 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep Density Gradient Medium – 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
| Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat) | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306-1L | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US |
| Glass Pippette – 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| Pipette bulb – 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
| BRAND® Petri dish, glass – 60×15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US |
| Sterile 24 Well Cell Culture Plate | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US |
| Hausser Hemacytometer (glass counting chamber) | Fischer Scientific | 02-671-6 | https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
| Glass Slides – 12 mm sterile cover glass – uncoated | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
| NeuN Rabbit Monoclonal Antibody – 100 µL | Abcam | ab177487 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:200 for 18 hours in 4 °C |
| MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody – 50 µL | Abcam | ab11267 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:500 for 18 hours in 4 °C |
References
- Qayumi, A. K., et al. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).
- Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
- Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).
- Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0. 5) C57Bl/6J mice. J Neurosci Methods. 149 (2), 110-120 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126 (3), 397-425 (1977).
- Graber, D. J., Harris, B. T. Purification and culture of spinal motor neurons from rat embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (4), 319-326 (2013).
- Anderson, K. N., Potter, A. C., Piccenna, L. G., Quah, A. K., Davies, K. E., Cheema, S. S. Isolation and culture of motor neurons from the newborn mouse spinal cord. Brain Res Prot. 12 (3), 132-136 (2004).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Brewer, G. J., et al. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
- Su, M., Zhong, W., Ren, S. Dose-dependent protection of reseveratrol against spinal cord ischemic-reperfusion injury in rats. Trop J Pharm Res. 15 (6), 1225-1233 (2016).
- Haapanen, H., et al. Remote ischemic preconditioning protects the spinal cord against ischemic insult: An experimental study in a porcine model. J Thorac Cardiovasc Surg. 151 (3), 777-785 (2016).
- Conrad, M. F., Ye, J. Y., Chung, T. K., Davison, J. K., Cambria, R. P. Spinal cord complications after thoracic aortic surgery: long-term survival and functional status varies with deficit severity. J Vasc Surg. 48 (1), 47-53 (2008).
- Wong, D. R., et al. Delayed spinal cord deficits after thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Ann Thorac Surg. 83 (4), 1345-1355 (2007).
- Freeman, K. A., et al. Alpha-2 agonist attenuates ischemic injury in spinal cord neurons. J Surg Res. 195 (1), 21-28 (2015).
- Freeman, K. A., et al. Spinal cord protection via alpha-2 agonist-mediated increase in glial cell-line-derived neurotrophic factor. J Thorac Cardiovasc Surg. 149 (2), 578-586 (2015).
