क्वांटिटेटिकल इमेजिंग तकनीकों का प्रयोग करके हिटरोकेल्लुलर जनसंख्या के भेदभाव और लक्षण वर्णन
Summary
गड़बड़ी के जवाब में हम हेटेरोसेल्यूलर जनसंख्या गतिशीलता के अध्ययन के लिए एक उपन्यास प्रोटोकॉल का विकास किया है। यह पांडुलिपि एक इमेजिंग-आधारित मंच का वर्णन करता है जो एक शक्तिशाली तरीके से हेटेरोसेल्यूलर आबादी के कई सेलुलर फ़िनोटाइप्स के एक साथ लक्षण वर्णन के लिए मात्रात्मक डेटासेट उत्पन्न करता है।
Abstract
सेलुलर प्रक्रियाएं जटिल हैं और कई सेल प्रकारों और उनके पर्यावरण के बीच परस्पर क्रिया से परिणाम। मौजूदा कोशिका जीव विज्ञान तकनीक अक्सर इस परस्पर क्रिया के सटीक व्याख्या की अनुमति नहीं देते हैं। मात्रात्मक इमेजिंग-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हम पर्यावरण उत्तेजनाओं में परिवर्तन के लिए विषम कोशिका आबादी की गतिशील फेनोटाइपिक प्रतिक्रियाओं ( यानी आकारिकी परिवर्तन, प्रसार, एपोपोसिस) को दर्शाने के लिए उच्च-सामग्री प्रोटोकॉल पेश करते हैं। हम आवेदन के आधार पर प्रतिदीप्ति तीव्रता या निहित आकारिकी विशेषताओं के आधार पर सेल प्रकार के बीच अंतर करने की हमारी क्षमता को हाइलाइट करते हैं। यह मंच परंपरागत कोशिका जीव विज्ञान के एल्स की तुलना में कम समय, अभिकर्मकों की छोटी मात्रा और त्रुटि की कम संभावना का उपयोग करते हुए उप-जनसंपर्क प्रतिक्रिया के अधिक व्यापक लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है। हालांकि, कुछ मामलों में, सेल की आबादी जटिल सेलू के आधार पर पहचान और मात्रा निर्धारित करना मुश्किल हो सकती हैLar सुविधाओं और अतिरिक्त समस्या निवारण की आवश्यकता होगी; हम प्रोटोकॉल में इन परिस्थितियों में से कुछ को उजागर करते हैं। हम कैंसर के मॉडल में दवा के जवाब का उपयोग करते हुए इस आवेदन को प्रदर्शित करते हैं; हालांकि, यह आसानी से अन्य शारीरिक प्रक्रियाओं के लिए अधिक मोटे तौर पर लागू किया जा सकता है यह प्रोटोकॉल किसी को सह-संस्कृति प्रणाली के भीतर उप-जनसांख्यिकी की पहचान करने और बाह्य उत्तेजनाओं के प्रत्येक के विशेष प्रतिक्रिया को चिह्नित करने की अनुमति देता है।
Introduction
सेल-आधारित assays बुनियादी अनुसंधान और दवा विकास सेटिंग्स में एक workhorse किया गया है हालांकि, इन मानक assays की सीमाएं इन विट्रो और नैदानिक डेटा और एफडीए के अनुमोदन प्राप्त करने के लिए सबसे अधिक दवाओं की विफलता के बीच में अंतर के साथ तेजी से स्पष्ट हो गए हैं। यहां, हम प्रासंगिक, सह-उत्पन्न होने वाली पर्यावरणीय उत्तेजनाओं के जवाब में हेटेरोसेल्यूलर फेनोटाइप का विश्लेषण करने के लिए मात्रात्मक इमेजिंग का उपयोग करने के लिए एक उपन्यास विधि प्रस्तुत करते हैं।
पारंपरिक सेल-आधारित एसेज जो कि सेल व्यवहार्यता को मापने के लिए उपयोग किए जाते हैं उनमें शामिल हैं: ट्राइपैप नीली बहिष्कार एशेज, एमटीटी / एमटीएस, और एनेक्सिन वी-एफआईटीसी फ्लो साइटोमेट्री स्टेंसिंग। ट्रिपैन नीले बहिष्कार assays, जबकि सरल और सस्ती, बड़ी संख्या में कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, समय लगता है, और अक्सर उपयोगकर्ता पूर्वाग्रह 1 से प्रभावित होता है। एमटीटी और एमटीएस की जांच अप्रत्यक्ष रूप से मिटोकोन्ड्रियल चयापचय दर की माप के माध्यम से सेल व्यवहार्यता को मापते हैं। हालांकि, चयापचय activiटी कोशिकाओं के विभिन्न संस्कृति स्थितियों (जैसे मीडिया या ऑक्सीजन एकाग्रता) से प्रभावित हो सकता है, जो गलत परिणामों की ओर जाता है और सेल प्रकार और शर्तों 2 , 3 में मानकीकरण को रोकता है। इन तकनीकों का एक और बड़ा नुकसान उनकी एकाधिक सेल प्रकारों के बीच अंतर करने में असमर्थता है – सबसे जैविक प्रणालियां हीरोकोसेल्युलर हैं। जबकि प्रवाह साइटमैट्री पद्धति में कई सेल आबादी के बीच अंतर करने की क्षमता होती है, सेल लेबल आवश्यक हैं, गतिशील नमूना चुनौतीपूर्ण है, और अनुयायी कोशिकाओं का उपयोग करते समय, यह अनुप्रयोग समय-उपभोक्ता और त्रुटि प्रवण बन जाता है।
अन्य महत्वपूर्ण सेलुलर फ़िनोटीप्प्स, जिसमें रूपवाचक परिवर्तन शामिल हैं, पर्यावरण उत्तेजनाओं के जवाब में होते हैं लेकिन पारंपरिक सेल-आधारित एसेज़ द्वारा नहीं पकड़े जाते हैं। प्रोफाइलिंग कोशिका के रूप में नमूनों में वर्णनात्मक लक्षण वर्णन और मानचित्रण समानता के माध्यम से एक शक्तिशाली, निष्पक्ष उपकरण हैमूल सेल जीव विज्ञान और दवा की खोज सहित बुनियादी और अनुवादिक अनुसंधान के कई पहलुओं में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करने की क्षमता 4 इसके अलावा, ट्यूमर सेल आकारिकी को ट्यूमर उपप्रकार 5 और आक्रामकता 6 के साथ सहसंबंधी होना दिखाया गया है। इसलिए, इन सेलुलर सुविधाओं का अध्ययन करने के लिए और यह कि वे विशिष्ट पर्यावरणीय परिवर्तनों से कैसे संबंधित हैं, यह बहुत रुचि है। इसके अतिरिक्त, एक सह-संस्कृति प्रणालियों में उप-जनसंख्या के बीच भेदभाव करने के लिए, रूपात्मक सुविधाओं में अंतर का उपयोग कर सकता है। फ्लोरोसेंटली लेबलिंग कोशिकाओं में गिरावट होती है ( यानी निहित सेल गुणों को बदलना, समय लेने वाली) और इसलिए सेल प्रकार वर्गीकृत करने के लिए अतिरिक्त तरीके लाभप्रद हैं।
माइक्रोस्कोपी-आधारित इमेजिंग एक मल्टीप्लेक्स, मात्रात्मक और मजबूत तरीके से सेलुलर फ़िनोइटिप्स के प्रोफाइलिंग के लिए एक वैकल्पिक तरीका है। इस पांडुलिपि में, हम विकास को उजागर करने के लिए हमारी मात्रात्मक इमेजिंग पाइपलाइन लागू करते हैंएक ट्यूमर के भीतर विषम सेल आबादी की नारी गतिशीलता। हम गैर-लघु सेल फेफड़े के कैंसर (एनएससीएलसी) कोशिकाओं और कैंसर-संबंधित फाइब्रोब्लास्ट (सीएएफ) के बीच बातचीत पर ध्यान देते हैं, ट्यूमर में पाए जाने वाले सबसे प्रचलित स्ट्रॉम्बल सेल प्रकार। सीएएफ ट्यूमर की दीक्षा, प्रगति और चिकित्सीय प्रतिक्रिया में निहित हैं; इसलिए, सीएएफ की अनुपस्थिति में ट्यूमर कोशिकाओं पर फेनोटाइपिक एनावेस करना 7 , 8 , 9 को गुमराह कर सकता है। विशेष रूप से, हम एरोलेटिनिब के जवाब में ट्यूमर कोशिकाओं पर सीएएफ के प्रभावों का मूल्यांकन करते हैं, एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (ईजीएफआर) को लक्षित करने वाले एक छोटे अणु जो अक्सर एनएससीएलसी के नैदानिक उपचार में उपयोग किया जाता है। हमने मूल्यांकन के लिए एक उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग प्लेटफ़ॉर्म और इसके साथ में छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग किया; हालांकि, इस पद्धति को अन्य शोधकर्ताओं के लिए सुलभ बनाने के प्रयास में हमने ओपन सोर्स सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके एक तुलनीय डाउनस्ट्रीम प्रोटोकॉल विकसित किया है:सेलफ़ोफर 10 और सेलफ्रॉयलर विश्लेषक 11 अधिकांश छवि-आधारित उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग assays का विश्लेषण एक दिया गया उपकरण मॉडल के लिए विशिष्ट वाणिज्यिककृत सॉफ्टवेयर के साथ किया जाता है। परिणाम दूसरे सॉफ्टवेयर के साथ अन्य प्रयोगशालाओं में दोहराने के लिए मुश्किल होते हैं क्योंकि अंतर्निहित एल्गोरिदम अक्सर मालिकाना होते हैं। औषधि उपचार के प्रति प्रतिक्रिया में प्रतिरक्षा- और आकारिकी-आधारित वर्गीकरण का उपयोग करते हुए, इस चित्र-आधारित पाइप लाइन, कोशिका प्रसार, मृत्यु और हेटोरोसेले्यूलर कल्चर के प्रत्येक उप-जनन का आकृति विज्ञान का उपयोग किया गया था। निम्नलिखित प्रोटोकॉल जटिल सेलुलर प्रक्रियाओं की जांच के लिए एक मजबूत पद्धति प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol described above improves upon current cell biology assays by providing more comprehensive insights into phenotypic dynamics of multiple cell types in response to environmental perturbations while using reduced reagents and time. A major advantage of this experimental design is the ability to analyze multiple phenotypes with a single setup and generate quantitative data characterizing these phenotypes on a single cell level. One technical advantage to this platform is the ease of initial troubleshooting compared to other assays. Because this method is image-based, one is able to visualize the wells for apparent over/under seeding. It is advisable to have cells in the exponential growth phase for the duration of the experiment and not be limited by nutrient or spatial constraints or confounded by senescence due to scarce seeding. Otherwise, birth and death rates may not be reproducible between experiments. For reference, CellPD is a publicly available program for computation of birth and death rates14. Additionally, one can visualize whether adequate concentrations of dyes were added to each well. Pipetting issues in an individual well could result in missegmentation and skewed data, but can easily be detected with the aforementioned protocol.
Unfortunately, not all cell types may be amenable to this application. It is important to be able to accurately segment the nuclei and cells, therefore analysis of cells that organize in more sphere-like or clumped structures may not be suitable. For some cells, it also may be advantageous to use a cell strainer prior to seeding to ensure initial seeding of single cells. In addition, the linear classifier technique is only applicable to cell types that can be readily distinguished based on morphology features.
For the success of the protocol, it is important to first optimize the imaging conditions, as the validity of downstream analyses is dependent on the quality of the images. While here we performed experiments using a high-content screening platform, image acquisition can also be performed using any fluorescent microscope (although an automated imaging platform is ideal for high-throughput approaches). Test images should be taken prior to each imaging time point to ensure that there are no problems with the microscope or protocol. The signal to noise ratio should be high, especially for the channels that will be used for segmentation (i.e. nuclei, cell stains). Additionally, it is important to image in the optimal plane of focus. If the images are out of focus, segmentation becomes much more difficult and the calculated morphological features will likely be inaccurate. Illumination differences between fields can cause problems with image segmentation as well. Large differences in brightness make the automated selection of threshold values difficult. Additionally, if there are heterogeneous fluorescence intensities between cells, a single threshold value may not sufficiently segment all the cells in an image. In this analysis, these problems were overcome by creating masks around brighter and dimmer cell populations and segmenting each population separately.
While the phenotypes under investigation in this protocol are limited to live, dead, and morphological characterization, they can easily be expanded to investigate other features. For example, functional genetic studies can be added with RNAi, overexpression, or other chemical perturbations.
In this paper, the capabilities of the protocol to measure the response of non-small cell lung cancer cells to erlotinib in the presence and absence of CAFs was demonstrated. However, this is merely one example of the many cell types and microenvironmental parameters that can be tested. We have extended this protocol to be used with other cell types and drug studies, including primary cells isolated from patient tumors13,15.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नाना कैंसर इंस्टीट्यूट (एनसीआई) ग्रांट्स यू 54 सीए 1414 9 8 9 और यू 54 सीए 143 9 7 के द्वारा दाना-फार्बर कैंसर संस्थान और दक्षिणी कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय में शारीरिक विज्ञान-ओंकोलॉजी सेंटर (पीएस-ओसी) स्थापित करने के लिए वित्त पोषित किया गया था। एसएम मुममेन्थलर को एक पीएस-ओसी ट्रांसनवर्क पुरस्कार मिला जो इस काम में से कुछ का समर्थन करता था।
हम ओपेरेटा एचसीएस मंच के दान के लिए हमारे परोपकारी समर्थकों, विशेष रूप से स्टीफंसन परिवार, एमेट, टोनी और टेसा को अपनी गहरी आभार व्यक्त करना चाहते हैं। हम मार्गदर्शन के लिए जे फू और आस्था के आणविक चिकित्सा टीम के सदस्यों के लिए धन्यवाद करना चाहेंगे: डी। एगस नैदानिक मार्गदर्शन और सलाह के लिए, के। पात्च्स, प्रायोगिक डिजाइन के साथ सार्थक चर्चाओं के लिए, आर। रावत, छवि विश्लेषण प्रोटोकॉल में सहायता के लिए , जे। कैटज को ओपेरेटा के साथ तकनीकी सहायता के लिए, और पी। मैक्लीन और डी। रुडरमैन उपयोगी चर्चाओं और प्रतिक्रिया के लिए।
Materials
| RPMI-1640 | Corning | 10-040-CV | cell culture medium |
| FBS | Gemini | 100-106 | medium supplement |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | medium supplement |
| TC20 | Biorad | 1450102 | cell counter |
| TC20 slides with trypan blue | Biorad | 1450003 | cell counter slides |
| 96-well plates | Corning | 3904 | clear bottom black plates |
| Erlotinib | LC Laboratories | E-4007 | |
| DMSO | VWR | 317275-100ML | solution to resuspend drug |
| Hoechst | Invitrogen | H21491 | nuclear dye |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | dead cell stain |
| Cell Tracker Orange CMRA | Life Technologies | C34551 | whole cell stain |
| Operetta high content imaging system | Perkin Elmer | ||
| CellProfiler | Broad Institue | version 2.2.0 (rev 9969f42) | http://cellprofiler.org/releases/ |
| Cell culture incubator | Any cell culture incubator will be suitable – cells were cultured under 37 ºC at 5% CO2. | ||
| 15 mL Falcon conical tubes | Falcon | 14-959-53A | |
| 10 cm2 cell culture plates | TPP | 93040 |
References
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