La infusión subcutánea de neurotrofina 4 con bombas osmóticas o inyección muscular directa mejora el envejecimiento de los músculos laríngeos de la rata
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para describir el uso de la neurotrofina 4 (NTF4) sistemática y directamente para remodelar los músculos laríngeos envejecidos en ratas.
Abstract
La disfunción laríngea en los ancianos es una causa importante de discapacidad, desde trastornos de voz hasta disfagia y pérdida de los reflejos protectores de las vías respiratorias. Existen pocas terapias, si las hay, que apuntan a la disfunción del músculo laríngeo relacionada con la edad. Las neurotrofinas participan en la inervación muscular y la diferenciación de las uniones neuromusculares (NMJs). Se cree que las neurotrofinas potencian la transmisión neuromuscular aumentando la liberación del neurotransmisor. Las uniones neuromusculares (NMJs) se hacen más pequeñas y menos abundantes en los músculos laríngeos de rata envejecidos, con evidencia de denervación funcional. Exploramos los efectos de NTF4 para uso clínico futuro como un terapéutico para mejorar la función en el envejecimiento de los músculos laríngeos humanos. Aquí, proporcionamos el protocolo detallado para la aplicación sistémica y la inyección directa de NTF4 para investigar la capacidad de envejecimiento de la rata músculo laríngeo para remodelar en respuesta a la aplicación de NTF4. En este método, las ratas recibieron NTF4 ya sea sistemáticamente a través de oSmotic o por inyección directa a través de los pliegues vocales. Luego se diseccionaron los músculos laríngeos y se utilizaron para el examen histológico de morfología y la denervación relacionada con la edad.
Introduction
Los músculos laríngeos se contraen rápida y consistentemente y son vulnerables a los efectos adversos del envejecimiento. Se cree que esta actividad constante contribuye a problemas de voz o disfagia observados en personas mayores de 65 años 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Varios mecanismos moleculares y fisiopatológicos contribuyen a esta disfunción relacionada con la edad. Estos mecanismos pueden incluir la remodelación de la mucosa laríngea, la atrofia o pérdida de las fibras musculares, la falta de regeneración de las fibras musculares o la atrofia que provoca el arqueamiento de los pliegues vocales y la incapacidad del cierre de la glotis 8 , 9 , 10 , 11 . No hay terapia médica comprobada en este momento que pueda comPara prevenir o rehabilitar estos cambios relacionados con la edad en estos músculos.
La modulación de la efectividad de la transmisión neuromuscular puede influir en gran medida en el rendimiento neuromotor. La familia de neurotrofinas incluye el factor de crecimiento nervioso (NGF), el factor de crecimiento nervioso derivado del cerebro (BDNF), la neurotrofina 3 (NTF3) y NTF4 12 , 13 . Se ha demostrado que las neurotrofinas modulan la eficacia sináptica 1 , 4 . El factor de crecimiento de los hepatocitos, el factor de crecimiento transformante beta y el factor de crecimiento de los fibroblastos se han utilizado recientemente en seres humanos para el tratamiento de las cicatrices de los pliegues vocales 15 – 17 . NTF4 también regula la eficacia de NMJ; Los ratones que carecen de NTF4 muestran NMJs desmontados 11 , 18 , 19 . Estos estudios llevan a efectos prometedores de tratamientosT de trastornos del músculo laríngeo envejecido y denervación con factores de crecimiento.
La terapéutica de inyección directa a los tejidos de los pliegues vocales no es sin precedentes en los seres humanos. Por ejemplo, las inyecciones locales de toxina botulínica se utilizan actualmente como un tratamiento eficaz para los trastornos del movimiento neurológico que afectan a los músculos de la laringe, como la disfonía espasmódica y la parálisis bilateral del nervio laríngeo recurrente 20 , 21 . El hidrogel de ácido hialurónico es otro inyectable, que se utiliza para tratar la cicatrización del pliegue vocal y la insuficiencia glotal 22 , 23 . La laringoplastia por inyección se puede utilizar para tratar una variedad de trastornos de la comunicación 24 . Estos métodos de inyección directa prometen mejorar la función vocal y tragar en las poblaciones de envejecimiento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los músculos laríngeos son vulnerables a los efectos desfavorables del envejecimiento. Estudios previos han demostrado cambios en el envejecimiento de los músculos laríngeos que incluyen cambios en el tamaño de las fibras, el número total de fibras, la capacidad regenerativa, el tamaño NMJ y los cambios de cantidad, además de las variaciones en la función contráctil y la isoforma de la miosina 4 , 11 , 27 ,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional sobre la Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación (R21DC010806 a CAM y JCS y R01DC011285 a CAM).
Materials
| Neurotrophin 4 | Pepro Tech | 450-04 | 200ng in 50μl |
| Alzet Osmotic Pump | DURECT Corporation | 2001D | |
| 30° endoscope | Stoltz | 61029D | |
| 50mm 30 gauge 100-μl syringe | Hamilton | 84850 and 201812 | |
| saline (sodium chloride solution) | Sigma-Aldrich | S8776 | |
| ketamine hydrochloride | Henry Schein | 56344 | |
| xylazine hydrochloride | Henry Schein | 33198 | |
| 25 G 5/8 needle | Becton-Dickinson | 305901 | |
| 1 ml syringe | Becton-Dickinson | 309659 | |
| ophthalmic ointment | Henry Schein | 8897 | |
| clippers | Oster | 44-018 | |
| ethanol | Decon | 2716 | |
| iodine (Betadine) | Purdue Pharma L.P. | 606404 | |
| heating pad | Sunbeam | 731-5 | |
| 5-0 nylon suture thread | AD Surgical | PMN-518R6 | |
| crile hemostat | Fine Science Tools | 13005-14 | |
| delicate suture tying forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| meloxicam | Henry Schein | 49756 | |
| carprofen | Merritt Veterinary Supplies | 148700 | |
| antibiotic ointment | Henry Schein | 57110 | |
| acepromizine Aceproject | Henry Schein | 3845 | |
| isoflurane Isothesia | Henry Schein | 50033 | |
| induction box (anesthetizing box) | Harvard Apparatus | 50-0116 | |
| oxygen compressed tank | Scott Gross | UN1072 | |
| plexiglas platform | Small Parts Inc (Amazon) | ||
| rubber tipped forceps | Fine science tools rubber | 11075-00 | |
| liquid rubber for forceps above | Lowe's | 42518 | |
| plastic spectula (BD syringe cut to length) | Becton-Dickinson | 309659 | |
| halogen light source rhino-laryngeal stroboscope | Kay-Pentax | RLS 9100 B | |
| video recorder | Kay-Pentax | ||
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-500G | |
| phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| cryostat Mictotom HM525 | Thermo Scientific | HM 525 | |
| Gill 1 hematoxylin | VWR | 10143-142 | |
| Shandon eosin-Y alcoholic | Thermo Fisher Scientific | 6766007 | |
| anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | S0819 | |
| Texas red-X phalloidin | Sigma-Aldrich | T7471 | |
| alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | B-13422 | |
| Small animal anaesthesia machine | Smiths Medical | CDS 9000 |
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