تحت الجلد نيوروتروفين 4 التسريب باستخدام مضخات التناضحي أو الحقن العضلي المباشر يعزز الشيخوخة الجرذ العضلات الحنجرة
Summary
هنا، نقدم بروتوكول لوصف استخدام نيوروتروفين 4 (NTF4) بشكل منهجي ومباشرة لإعادة تشكيل الجرذ الشيخوخة عضلات الحنجرة.
Abstract
ضعف الحنجرة في كبار السن هو سبب رئيسي للإعاقة، من اضطرابات الصوت إلى عسر البلع وفقدان ردود الفعل واقية مجرى الهواء. عدد قليل، إن وجد، توجد علاجات تستهدف ضعف العضلات الحنجرة المرتبطة بالعمر. وتشارك نيوروتروفينز في تعصيب العضلات والتمايز من تقاطعات العصبية والعضلية (نمجس). ويعتقد أن نيوروتروفينز تعزيز انتقال العصبي العضلي عن طريق زيادة الإفراج العصبي. تقاطعات العصبية والعضلية (نمجس) تصبح أصغر وأقل وفرة في الشيخوخة عضلات الحنجرة الفئران، مع أدلة على التعصيب الوظيفي. استكشفنا آثار NTF4 للاستخدام السريري في المستقبل باعتباره العلاجية لتحسين وظيفة في الشيخوخة عضلات الحنجرة البشرية. هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصل لتطبيق النظامية والحقن المباشر لل NTF4 للتحقيق في قدرة الشيخوخة الفئران العضلات الحنجرة لإعادة تشكيل ردا على تطبيق NTF4. في هذه الطريقة، تلقت الفئران إما NTF4 إما بشكل منهجي عبر oمضخة ضخية أو عن طريق الحقن المباشر من خلال طيات الصوتية. ثم تم تشريح عضلات الحنجرة واستخدامها للفحص النسيجي للمورفولوجيا والتعصيب المرتبط بالعمر.
Introduction
عضلات الحنجرة تتعاقد بسرعة وباستمرار، وهي عرضة للآثار السلبية للشيخوخة. ويعتقد أن هذا النشاط المستمر للمساهمة في مشاكل الصوت أو عسر البلع لوحظ في الأشخاص فوق 65 سنة من العمر 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 ، 7 . تساهم العديد من الآليات الجزيئية و الفيزيولوجية المرضية في هذا الخلل المرتبط بالعمر. ويمكن أن تشمل هذه الآليات إعادة عرض الغشاء المخاطي للحنجرة، وضمور الألياف العضلية أو فقدان، وعدم تجديد الألياف العضلية أو ضمور الذي يسبب الركوع من طيات الصوتية وعدم القدرة على إغلاق المزمار 8 ، 9 ، 10 ، 11 . لا يوجد علاج طبي مؤكد في هذا الوقت يمكن أن كوممنع أو إعادة تأهيل هذه التغيرات المرتبطة بالعمر في هذه العضلات.
تعديل فعالية انتقال العصبية والعضلية يمكن أن تؤثر بشكل كبير الأداء الحركي. وتشمل عائلة نيوروتروفينز عامل نمو الأعصاب (نغف)، الدماغ المستمدة عامل نمو الأعصاب (بدف)، نيوروتروفين 3 (NTF3) و NTF4 12 ، 13 . وقد أظهرت نيوروتروفينز لتعديل فعالية متشابك 1 ، 4 . عامل نمو خلايا الكبد، وتحويل عامل النمو بيتا وعامل نمو الخلايا الليفية استخدمت مؤخرا في البشر لعلاج طية الصوتية تندب 15-17 . كما ينظم NTF4 فعالية نمج؛ الفئران تفتقر NTF4 تظهر تفكيكها نمجس 11 ، 18 ، 19 . هذه الدراسات تؤدي إلى آثار واعدة من العلاجر من الشيخوخة اضطرابات العضلات الحنجرة وإزالة التعصيب مع عوامل النمو.
العلاجات الحقن المباشر لأنسجة الطيات الصوتية ليست غير مسبوقة في البشر. على سبيل المثال، يتم استخدام الحقن المحلية من توكسين البوتولينوم حاليا كعلاج فعال لاضطرابات الحركة العصبية التي تؤثر على عضلات الحنجرة، مثل خلل النطق التشنجي والشلل العصبي الحنجري الثنائي المتكرر 20 ، 21 . حمض الهيالورونيك هيدروجيل هو آخر عن طريق الحقن، والذي يستخدم لعلاج شظية أضعاف شحذ و غلوتال قصور 22 ، 23 . حقن الحنجرة يمكن استخدامها لعلاج مجموعة متنوعة من اضطرابات الاتصالات 24 . هذه طرق الحقن المباشر عقد وعود لتحسين وظيفة الصوتية والبلع في الشيخوخة السكان.
Protocol
Representative Results
Discussion
عضلات الحنجرة عرضة للآثار غير المواتية للشيخوخة. وقد أظهرت الدراسات السابقة التغيرات في عضلات الحنجرة الشيخوخة التي تشمل التغيرات في حجم الألياف، العدد الإجمالي للألياف، والقدرة التجدد، حجم نمج وكمية التغييرات، بالإضافة إلى الاختلافات في وظيفة مقلص والتحولات الإ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الوطني للصمم وغيرها من اضطرابات الاتصالات (R21DC010806 إلى كام و جسس و R01DC011285 إلى كام).
Materials
| Neurotrophin 4 | Pepro Tech | 450-04 | 200ng in 50μl |
| Alzet Osmotic Pump | DURECT Corporation | 2001D | |
| 30° endoscope | Stoltz | 61029D | |
| 50mm 30 gauge 100-μl syringe | Hamilton | 84850 and 201812 | |
| saline (sodium chloride solution) | Sigma-Aldrich | S8776 | |
| ketamine hydrochloride | Henry Schein | 56344 | |
| xylazine hydrochloride | Henry Schein | 33198 | |
| 25 G 5/8 needle | Becton-Dickinson | 305901 | |
| 1 ml syringe | Becton-Dickinson | 309659 | |
| ophthalmic ointment | Henry Schein | 8897 | |
| clippers | Oster | 44-018 | |
| ethanol | Decon | 2716 | |
| iodine (Betadine) | Purdue Pharma L.P. | 606404 | |
| heating pad | Sunbeam | 731-5 | |
| 5-0 nylon suture thread | AD Surgical | PMN-518R6 | |
| crile hemostat | Fine Science Tools | 13005-14 | |
| delicate suture tying forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| meloxicam | Henry Schein | 49756 | |
| carprofen | Merritt Veterinary Supplies | 148700 | |
| antibiotic ointment | Henry Schein | 57110 | |
| acepromizine Aceproject | Henry Schein | 3845 | |
| isoflurane Isothesia | Henry Schein | 50033 | |
| induction box (anesthetizing box) | Harvard Apparatus | 50-0116 | |
| oxygen compressed tank | Scott Gross | UN1072 | |
| plexiglas platform | Small Parts Inc (Amazon) | ||
| rubber tipped forceps | Fine science tools rubber | 11075-00 | |
| liquid rubber for forceps above | Lowe's | 42518 | |
| plastic spectula (BD syringe cut to length) | Becton-Dickinson | 309659 | |
| halogen light source rhino-laryngeal stroboscope | Kay-Pentax | RLS 9100 B | |
| video recorder | Kay-Pentax | ||
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-500G | |
| phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| cryostat Mictotom HM525 | Thermo Scientific | HM 525 | |
| Gill 1 hematoxylin | VWR | 10143-142 | |
| Shandon eosin-Y alcoholic | Thermo Fisher Scientific | 6766007 | |
| anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | S0819 | |
| Texas red-X phalloidin | Sigma-Aldrich | T7471 | |
| alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | B-13422 | |
| Small animal anaesthesia machine | Smiths Medical | CDS 9000 |
References
- Trupe, E. H., et al. Correlates and consequences of eating dependency in institutionalized elderly. J. Am. Geriatrics Society. 34 (3), 192-198 (1986).
- Ward, P. H., Colton, R., McConnell, F., Malmgren, L., Kashima, H., Woodson, G. Aging of the voice and swallowing. Otolaryngol. Head Neck Surg. 100 (4), 283-286 (1989).
- Gay, E. G., Kronenfeld, J. J., Dettmann, F. G. A comparison on the effect of regulation on health care for the older American: a tale of two states. Gerontologist. 34 (6), 787-796 (1994).
- Hagen, P., Lyons, G. D., Nuss, D. W. Dysphonia in the elderly:diagnosis and management of age-related voice changes. South. Med. J. 89 (2), 204-207 (1996).
- Broniatowski, M., et al. Current evaluation and treatment of patients with swallowing disorders. Otolaryngol. Head Neck Surgery. 120 (4), 464-473 (1999).
- Lundy, D. S., et al. Aspiration: cause and implications. Otolaryngol. Head Neck Surg. 120 (4), 474-478 (1999).
- Schindler, J. S., Kelly, J. H. Swallowing disorders in the elderly. Laryngoscope. 112 (4), 589-602 (2002).
- Gambino, D. R., Malmgren, L. T., Gacek, R. R. Age-related changes in the neuromuscular junctions in the human posterior cricoarytenoid muscles: a quantitative study. Laryngoscope. 100 (3), 262-268 (1990).
- Sinard, R. J. The aging voice: how to differentiate disease from normal changes. Geriatrics. 53 (7), 76-79 (1998).
- Baker, K. K., Olson-Raming, L., Sapir, S., Luschei, E. S., Smith, M. E. Control of vocal loudness in young and old adults. J. Speech Lang. Hear Res. 44 (2), 297-305 (2001).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 64 (4), 435-442 (2009).
- Lai, K., Ip, N. Y. Postsynaptic signaling of new players at the neuromuscular junction. J. Neurocytol. 32 (5-8), 727-741 (2003).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24 (1), 677-736 (2012).
- Gonzalez, M., et al. Disruption of Trkb mediated signaling induces disassembly of postsynaptic receptor clusters at neuromuscular junctions. Neuron. 24 (3), 567-583 (1999).
- Hirano, S., Kishimoto, Y., Suehiro, A., Kanemaru, S., Ito, J. Regeneration of aged vocal folds: first human case treated with fibroblast growth factor. Laryngoscope. 118 (12), 2254-2259 (2008).
- Branski, R. C., et al. Effects of transforming growth factor-beta 1 on human vocal fold fibroblasts. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 118 (3), 218-226 (2009).
- Kishimoto, Y., et al. Effects of exogenous hepatocyte growth factor on vocal fold fibroblasts. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 118 (8), 606-611 (2009).
- Belluardo, N., et al. Neuromuscular junction disassembly and muscle fatigue in mice lacking neurotrophin-4. Mol. Cell. Neurosci. 18 (1), 56-57 (2001).
- Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanisms in the old rat. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (12), 1458-1468 (2013).
- Roscow, D. E., Parikh, P., Vivero, R. J., Casiano, R. R., Lundy, D. S. Considerations for initial dosing of botulinum toxin in treatment of adductor spasmodic dysphonia. Oto. HeadNeck Surg. 148 (6), 1003-1006 (2013).
- Benninger, M. S., Hanick, A., Hicks, D. M. Cricothyroid muscle botulinum toxin injection to improve airway for bilateral recurrent laryngeal nerve paralysis, A case series. J. Voice. 30 (1), 96-99 (2016).
- Coppoolse, J. M. S., et al. An in vivo study of composite microgels based on hyaluronic acid and gelatin for the reconstruction of surgically injured rat vocal folds. J. Speech Lang Hear Res. 57 (2), S658-S673 (2014).
- Hertegård, S., et al. Cross-linked hyaluronan used as augmentation substance for treatment of glottal insufficiency: Safety aspects and vocal fold function. Laryngoscope. 112 (12), 2211-2219 (2002).
- Walker, W. F., Homberger, D. G. . Anatomy and dissection of the rat. , (1997).
- Ohno, T., Hirano, S., Rousseau, B. Age-associated changes in the expression and deposition of vocal fold collagen and hyaluronan. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 25 (1), 192-197 (2009).
- Stemple, J. C., et al. Enhancement of aging rat laryngeal muscles with endogenous growth factor treatment. Physiol. Rep. 4 (10), e12798 (2016).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Contractile dysfunction and altered metabolic profile of the aging rat thyroarytenoid muscle. J. Appl. Phys. 100 (2), 602-608 (2006).
- Engle, W. K., Cunningham, G. C. Rapid examination of muscle tissue. An improved trichrome method for fresh-frozen biopsy section. Neurology. (13), 919-923 (1963).
- Sheehan, D. C., Hrapchack, B. B. Theory and practice of histotechnology. Battelle. , (1980).
- Kulakowski, S. A., Parker, S. D., Personius, K. E. Reduced TrkB expression results in precocious age-like changes in neuromuscular structure, neurotransmission, and muscle function. J. Appl. Phys. 111 (3), 844-852 (2011).
- Nishida, N., et al. Age-related change in rat intrinsic laryngeal muscles: analysis of muscle fibers, muscle fiber proteins and subneural apparatuses. Eur Arch Otorhinolaryngol. 270 (3), 975-984 (2013).
