Геномное картирование белково-ДНК-взаимодействий с ChEC-seq in<em> Разное</em

Сопоставление сайтов связывания факторов транскрипции (ТФ), ремоделиров хроматина и других связанных с хроматином регуляторных факторов является ключом к пониманию всех процессов на основе хроматина. В то время как подходы хромотанового иммунопреципитации и высокопроизводительного секвенирования (ChIP-seq) были использованы для получения многих важных сведений о биологии генома, они имеют значительные ограничения. Недавно мы представили альтернативный метод, называемый эндогенным расщеплением хроматина и секвенированием с высокой пропускной способностью (ChEC-seq) ¹ , чтобы обойти эти недостатки.

ChIP-seq чаще всего проводят с начальной стадией поперечной сшивки формальдегида (X-ChIP-seq) для сохранения взаимодействия белок-ДНК. Однако в ряде недавних исследований было показано, что X-ChIP-seq захватывает переходные или неспецифические белково-ДНК-взаимодействия ^{2 , 3 , 4 , 5} <Sup>, ^{6 , 7 , 8} , что приводит к появлению ложноположительных сайтов связывания. Кроме того, обработка ультразвуком, обычно используемая для фрагментации хроматина в экспериментах X-ChIP-seq, предпочтительно сдвигает области открытого хроматина, что приводит к необъективному извлечению фрагментов из этих областей ^{9 , 10} . Ультразвук также дает гетерогенную смесь длин фрагментов, в конечном счете ограничивая разрешение сайта-сайта, хотя добавление стадии экстрагирования экзонуклеазой может значительно улучшить разрешение ^{11 , 12} . Нативные методы ChIP, такие как оккупированные области геномов из очищенного от аффинности естественно выделенного хроматина (ORGANIC) ¹³ , не используют сшивание и фрагмент хроматина с микрококковой нуклеазой (MNase), уменьшая потенциальные смещения, связанные с сшиванием формальдегида и ультразвуком. Однако,Растворимость многих белков, связанных хроматинами, в относительно мягких условиях, необходимых для естественной экстракции хроматина, является плохим, что потенциально приводит к уменьшению динамического диапазона и / или ложных негативов ¹⁴ .

В то время как различные итерации ChIP-seq наиболее часто используются для картирования белок-ДНК в геноме, были также реализованы несколько методов картирования, основанных на слиянии белков, представляющих интерес для различных модифицирующих ДНК ферментов. Одним из таких подходов является идентификация ДНК-аденин-метилтрансферазы ДНК (DamID) ¹⁵ , где интересующий хроматин белок, представляющий интерес, генетически слит с плотиной, и этот синтез экспрессируется в клетках или животных, что приводит к метилированию последовательностей GATC, близких к сайтам связывания белка. DamID выгодно тем, что он не полагается на иммунопреципитацию и поэтому избегает сшивания, антител или солюбилизации хроматина. Он также выполняется in vivo . Однако, Разрешение DamID ограничено шкалой килобаз, и метилирующая активность слитого белка плотины является конститутивной. Второй способ, основанный на ферментативном слиянии, – это Calling Card-seq ¹⁶ , в котором используется слияние интересующего фактора с транспозазой, направляя специфическую для сайта интеграцию транспозонов. Подобно DamID, Calling Card-seq не основан на иммунопреципитации и, следовательно, имеет схожие преимущества, с дополнительным преимуществом повышенного разрешения. Однако Call-Card-seq может быть ограничена последовательными смещениями транспозаз и также зависит от наличия сайтов рестрикции, близких к сайтам вставки транспозонов.

Третий метод ферментативного слияния, разработанный в лаборатории Laemmli, представляет собой эндогенное расщепление хроматина (ChEC) ¹⁷ . В ChEC слияние между хроматин-ассоциированным белком и MNase экспрессируется в клетках, а после добавления кальция для активации MNase ДНК расщепляется проксимально к сайтам связывания для меченыхФактора ( рис. 1 ). В сочетании с Саузерн-блоттингом ChEC использовался для характеристики структуры хроматина и связывания белка в ряде отдельных локусов в дрожжах ^{17 , 18} и был объединен с микроматричным анализом с низким разрешением для зондирования взаимодействия компонентов ядерных пор с дрожжами Геном ¹⁹ . ChEC предлагает преимущества, подобные DamID и Calling Card-seq, и его разрешение почти однопалубной пары при анализе с помощью расширения ¹⁹ праймера. ChEC также контролируема: надежное расщепление ДНК с помощью MNase зависит от добавления миллимолярного кальция, гарантируя, что MNase неактивен при низких концентрациях свободного кальция, наблюдаемых в живых дрожжевых клетках ²⁰ .

Ранее мы предположили, что объединение ChEC с высокопроизводительным секвенированием (ChEC-seq) обеспечит карты с высоким разрешением сайтов привязки TF. Действительно, ChEC-seq генерирует карты высокого разрешения почкообразующих общих регуляторных факторов (GRF) Abf1, Rap1 и Reb1 в геноме ¹ . Мы также успешно применили ChEC-seq к модульному медиаторному комплексу, сохраняющемуся, существенному глобальному транскрипционному коактиватору ²¹ , расширяющему применимость ChEC-seq к комплексам размером в мегадальтон, которые напрямую не связаны с ДНК и могут быть трудно отображены ChIP- Основанные методы. ChEC-seq является мощным методом как для независимой проверки результатов ChIP-seq, так и для генерации новых представлений о регулировании хроматин-резидентных процессов. Здесь мы представляем пошаговый протокол для реализации этого метода в почкодоносных дрожжах.