Обогащение моющего средства нерастворимого белка агрегатов от мозга человека посмертный
Summary
Описан сокращенное фракционирование протокол для обогащения моющего средства нерастворимого белка агрегатов от человека посмертных мозг.
Abstract
В этом исследовании мы описываем сокращенное одноступенчатых фракционирование протокол для обогащения моющего средства нерастворимого белка агрегатов от человека посмертных мозг. Ионных моющее N-лаурил sarcosine (sarkosyl) эффективно solubilizes изначально сложенном белков в ткани мозга, позволяя обогащения моющего средства нерастворимого белка агрегатов от широкий спектр нейродегенеративных proteinopathies, такие как Болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона и боковой амиотрофический склероз и прионы заболеваний. Человеческого контроля и AD посмертных мозга тканей были гомогенизированные и осевших ultracentrifugation присутствии sarkosyl обогатить моющего средства нерастворимого белка агрегаты, включая патологическое фосфорилированных Тау, основной компонент нейрофибриллярных связок в AD. Западный blotting продемонстрировал дифференциального растворимость агрегированных фосфорилированных Тау и моющих средств растворимого белка, раннего Endosome Antigen 1 (ЕЕА1) управления и AD мозга. Протеомного анализа также выявлено обогащение β-амилоида (значения), Тау, snRNP70 (U1 – 70 K) и аполипопротеина Е (АРОЕ) в sarkosyl нерастворимые фракций AD мозга по сравнению с теми из элемента управления, в соответствии с предыдущей стратегии фракционирование ткани . Таким образом этот протокол простого обогащения идеально подходит для широкого круга экспериментальных приложений, начиная от Западный blotting и функциональных белков Сопредседатель агрегации анализов массы на основе спектрометрии протеомики.
Introduction
Нейродегенеративные заболевания, как болезни Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD), болезни Гентингтона (HD), боковой амиотрофический склероз (ALS) и тесно связанных прионных заболеваний являются proteinopathies, характеризуется постепенным накоплением агрегатов моющего средства нерастворимого белка в головном мозге с сопутствующими когнитивных снижаться. 1 , 2 считается, что эта общая патологическая функция играть центральную роль в этиологии и патофизиологии этих нейродегенеративных заболеваний. 2 эти агрегаты обычно состоят из полимерных волокон амилоида, которые состоят из повторяющихся звеньев смятых протеинов экспонирования крест β-структуры. 1 , 2 , 3 , 4 биохимически, амилоида агрегаты обладают высокой устойчивостью к химическим или тепловой денатурации и солюбилизация,3 , который представляет уникальные проблемы для их очистки, анализ и исследование через традиционные биохимические методы. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 неудивительно, что моющее средство нерастворимые белковые фракции был в центре внимания многочисленных исследований в патофизиологии нейродегенеративных заболеваний, связанных с накоплением смятых протеинов. 6 , 12 , 13 , 14
Фракционирование биохимические методы часто были использованы для обогатить моющих средств нерастворимые фракция от гомогенатах мозга посмертных. 6 , 12 , 13 , 14 один из наиболее распространенных методов предполагает последовательное извлечение гомогенатах ткани с буферами и моющих средств увеличения жесткости, а затем ultracentrifugation для разделения фракций растворимых и нерастворимых. Часто используемых последовательных фракционирование протокола6,14 включает гомогенизацию образцов замороженные ткани в буфере моющее средство бесплатно низкой концентрацией соли (LS) и затем результирующая нерастворимых гранулы последовательно извлекаются с буферы содержащие высокий соль, неионогенные моющих средств, высоким сахарозы, ионные моющих средств и, наконец, chaotropes как мочевины. 6 , 14 очевидный недостаток такого последовательного фракционирование протоколов является значительное количество времени и труда обязательства, необходимые для их завершения. Включая гомогенизации и ultracentrifugation, типичный пятиступенчатый фракционирование протокол может занять несколько часов или даже дней для завершения. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 , Кроме того, как много патологического белка агрегатов остаются нерастворимых в всех исклучая суровых условий19,20 большинство созданных фракций имеют ограниченную ценность. Таким образом менее строгие фракционирование шаги, используя высокие концентрации соли и неионных моющих средств являются значительной степени излишним.
Предыдущие исследования показали, что ионные моющее N-лаурил sarcosine (sarkosyl) является отличным кандидатом для упрощенной одноступенчатых стиральный порошок фракционирование протокола. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 как денатурируя моющего средства sarkosyl является достаточно строгим, чтобы солюбилизировать последнего подавляющее большинство изначально сложенном белков в мозге без растворяющие смятых протеинов агрегатов состоит из бета амилоида (значения),6,11 фосфорилированных Тау (pTau),6 TAR ДНК-связывающих белков 43 (TDP-43),14 альфа synuclein,12,13 почесуха,23 или U1 малых ядерных ribonucleoproteins (U1 snRNPs) например U1 – 70 K. 5 , 21 , 22 Как sarkosyl является менее строгим, чем вездесущие анионные стиральный порошок натрия лаурилсульфат (SDS), она сохраняет менее надежные олигомерных формы агрегатов смятых протеинов, которые не могут выдержать SDS лечения. 9
Ранее мы описали сокращенное моющих средств фракционирование протокол, который достигнутые результаты, сопоставимые с более трудоемкий последовательных фракционирование методологий. 5 , опустив менее жесткие шаги фракционирования, мы смогли разработать протокол снисходительный одноступенчатых фракционирование для обогащения моющего средства нерастворимого белка агрегатов от посмертных человеческого мозга. 5 этот подробный протокол, описанные здесь хорошо подходит для широкого круга экспериментальных приложений, начиная от Западный blotting и массы на основе спектрометрии протеомики к сворачиванию функциональных белков и агрегации посева assays. 5 , 6 , 21
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представляем и обсудить сокращенное одноступенчатых моющих средств фракционирование протокол, который применяется для широкого ряда экспериментальных приложений, начиная от массы на основе спектрометрии протеомики анализа функциональных белков сворачиванию анализов и За?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Drs. Джим Lah и Аллан Levey, Эмори Кафедра неврологии, за полезные замечания и предложения. Эта работа частично финансируется путем ускорения медицины партнерство гранта (U01AG046161-02), Emory Альцгеймера болезнь научно-исследовательский центр (P50AG025688) и Национальный институт по проблемам старения предоставить (R01AG053960-01) N.T.S. Это исследование было также поддержано в невропатологии ядро Эмори неврологии NINDS основной зал Грант, P30NS055077.
Materials
| Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X) | Thermo Fisher | 78441 | protease & phosphatase inhibitor cocktail |
| Sonic Dismembrator System (ultrasonicator) | Fisher Scientific | FB505110 | microtip ultrasonicator |
| Optimax TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 361545 | refrigerated ultracentrifuge |
| TLA120.1 rotor | Beckman Coulter | 362224 | ultracentrifuge rotor |
| 500 ul (8x34mm) polycarbonate tubes, thickwall | Beckman Coulter | 343776 | ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor |
| 4X SDS sample buffer | Home-made | N/A | SDS-PAGE |
| TCEP solution, neutral pH | Thermo Fisher | 77720 | reducing agent |
| (TBS) blocking buffer | Thermo Fisher | 37542 | blocking buffer |
| (TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20 | Thermo Fisher | 37543 | blocking buffer and antibody diluent |
| 4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well | Thermo Fisher | NW04120BOX | precast SDS-PAGE gels |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher | B0002 | SDS-PAGE running buffer |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) | Sigma Aldrich | L5777-50G | detergent |
| 1.5 ml polypropylene Pellet Pestle | Kimble Chase | 749521-1500 | homogenization tool |
| cordless motor for Pellet Pestle | Kimble Chase | 749540-0000 | homogenization tool |
| Anti-Tau-2 (pan tau) antibody | Chemicon | MAB375 | antibodies |
| Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody | Millipore | MAB5450 | antibodies |
| Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8) | Thermo Fisher | MN1020 | antibodies |
| Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody | abcam | ab2900 | antibodies |
| Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A21058 | antibodies |
| Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A11374 | antibodies |
| iBlot2 Dry Blotting System | Thermo Fisher | IB21001 | Gel transfer |
| iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini | Thermo Fisher | IB23002 | Gel transfer |
References
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991 (1991).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
- Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).
- Hamley, I. W. The Amyloid Beta Peptide: A Chemist’s Perspective. Role in Alzheimer’s and Fibrillization. Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).
- Diner, I., et al. Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease. J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).
- Gozal, Y. M., et al. Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer’s Disease. J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).
- Hales, C. M., et al. Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer’s Disease progression. PROTEOMICS. , (2016).
- Julien, C., Bretteville, A., Planel, E., Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. . Amyloid Proteins: Methods and Protocols. , 473-491 (2012).
- Nizhnikov, A. A., et al. Proteomic Screening for Amyloid Proteins. PLoS ONE. 9 (12), e116003 (2014).
- Seyfried, N. T., et al. Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards. J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).
- Woltjer, R. L., et al. Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. FASEB J. , (2005).
- Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments. J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).
- Hasegawa, M., et al. Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions. J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130 (2006).
- Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association. FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
- Noguchi, A., et al. Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains. J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer’s disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer’s β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid. J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).
- Yang, L. -. S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis. J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Hales, C. M., et al. U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer’s disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21. Mol Neurodegener. 9 (1), 15 (2014).
- Xiong, L. -. W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
- Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer’s Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer’s disease. Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Guo, J. L., et al. Unique pathological tau conformers from Alzheimer’s brains transmit tau pathology in nontransgenic mice. J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).
- Matveev, S. V., et al. A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer’s disease brain. J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).
