Screening-Assays zur Charakterisierung neuartiger endothelialer Regulators der entzündlichen Reaktion beteiligt
Summary
Gefäßendothels steuert dicht Leukozyten Rekrutierung. Unzureichende Leukozyte Extravasation trägt zur entzündlichen Krankheiten des Menschen. Daher ist es notwendig, bessere Therapien für entzündliche Erkrankungen zu entwerfen, auf der Suche nach neuartigen regulatorischen Elemente der endotheliale Aktivierung. Hier beschreiben wir eine umfassende Methodik um neuartige endotheliale Regulatoren zu charakterisieren, die Leukozyten während einer Entzündung des Menschenhandels ändern können.
Abstract
Die endotheliale Schicht ist unerlässlich für die Aufrechterhaltung der Homöostase im Körper durch viele verschiedene Kontrollfunktionen. Verordnung der Entzündungsreaktion durch die endotheliale Schicht unbedingt effizient bekämpfen schädliche Eingaben und Hilfe bei der Wiederherstellung der beschädigten Bereiche. Wenn die Endothelzellen, einer entzündlichen Umgebung, wie die äußere Komponente von Gram-negativen Bakterien Membran, Lipopolysaccharid (LPS), ausgesetzt sind sie zum Ausdruck bringen wasserlöslicher Pro-inflammatorischen Zytokinen, wie Ccl5, Cxcl1 und Cxcl10, und Auslösen der Aktivierung des zirkulierenden Leukozyten. Der Ausdruck der Adhäsionsmoleküle E-Selektin, VCAM-1 und ICAM-1 auf der endothelial Oberfläche ermöglicht darüber hinaus das Zusammenspiel und die Adhäsion der aktivierten Leukozyten, die endotheliale Schicht, und schließlich die Extravasation auf das entzündete Gewebe. In diesem Szenario muss die endotheliale Funktion streng reguliert werden, da übermäßige oder fehlerhafte Aktivierung bei der Rekrutierung von Leukozyten zu entzündlichen Erkrankungen führen könnte. Da viele dieser Erkrankungen eine wirksame Behandlung nicht verfügen, müssen neue Strategien mit Fokus auf die vaskuläre Ebene untersucht werden. Wir bieten umfassende Tests, die auf der Suche nach neuartigen endotheliale Regulierungsbehörden nützlich sind, die Leukozyten-Funktion zu ändern. Wir analysieren endotheliale Aktivierung durch verschiedene Techniken, einschließlich Konkretisierung Ziele beteiligt bei der Rekrutierung von Leukozyten (z. B., Zytokine, Chemokine und Adhäsionsmoleküle) mit: Echtzeit-quantitative Polymerase-Kettenreaktion () RT-qPCR), Western-Blot, flow Cytometry und Adhäsion Assays. Diese Ansätze bestimmen die endotheliale Funktion im Zusammenhang mit entzündlichen und sind sehr nützlich für Screening-Tests um neuartige endotheliale entzündliche Regulierungsbehörden zu charakterisieren, die potenziell wertvoll für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien durchführen.
Introduction
Die Entzündung ist eine positive biologische Reaktion gegen infektiöse Agenzien, mit dem großen Ziel, den Erreger zu eliminieren und geschädigtes Gewebe zu reparieren. Unter bestimmten Bedingungen, z. B. chronische Infektionen oder Autoimmunerkrankungen beheben Entzündungen nicht. Stattdessen gibt es eine anomale Reaktion mit kontinuierlicher Infiltration der Leukozyten, wodurch eine verlängerte Immunantwort, die führt zu Gewebeschäden, Fibrose, Verlust der Funktion, und die allgemeine, Behinderung und in einigen Fällen zum Tod des Patienten. Diese menschliche Störungen, katalogisiert als entzündliche Erkrankungen beinhalten alle die Blutgefäße für die Kontrolle der Leukozyte Extravasation1,2.
Die Endothelzellen spielen eine grundlegende Rolle bei der Regulierung der Entzündungsreaktion durch Steuern, Handel mit Leukozyten. Wenn die endotheliale Schicht Entzündungsmediatoren wie LPS ausgesetzt ist, das ruhende Endothel aktiviert und drückt Pro-inflammatorischen Zytokinen (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1, etc.) und Adhäsionsmoleküle (E-Selektin, VCAM-1 und ICAM-1), gefallen Rekrutierung der zirkulierenden Leukozyten an der Infektionsstelle. Die Leukozyten, die dann durch die freigesetzten Zytokine grundiert zu vermitteln, Rollen und Interaktion mit der endotheliale Schicht durch die entsprechenden Klebstoff Gegenstücke: PSGL-1 bis Selektin, α4β1 Integrin VCAM-1 und αLβ2 Integrin ICAM-1. Zu guter Letzt migrieren der Leukozyten auf das Gefäßsystem in Richtung der Schwerpunkt der Entzündung3.
Die wichtige Rolle des Endothels bei der Regulierung der entzündlichen Reaktion wurde an Mäusen, die gentechnisch verändert wurden, um auszudrücken, die LPS-Rezeptor, Abgabe-wie Empfänger 4 (TLR4), nur auf die Endothelzellen nachgewiesen. Diese endotheliale TLR4 Tiere wurden reagieren zu einer LPS-vermittelte Entzündung und die Infektion erzeugt nach der Inokulation von Bakterien zu erkennen, und folglich zu erreichen Infektion Auflösung und Überleben auf ähnlichem Niveau wie die Wildtyp-Mäusen-4 , 5.
Für das Endothel reguliert Entzündungsreaktion Weg hat postuliert worden, dass die Hemmung in einigen Phasen der Leukozyten-Endothel-Interaktion bei der Reduktion von Trans-endothelialen Migration und eine bessere Prognose für führen würde entzündliche Erkrankungen. In der Tat wurden mehrere Strategien, die Ausrichtung auf die endotheliale Aktivierung und Leukozyten-Endothel-Interaktion entwickelt, Extravasation von Immunzellen zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen6,7zu behindern.
In diesem Bericht beschreiben wir eine gründliche Gruppe von in-vitro- Techniken die endotheliale Aktivität als Reaktion auf den Entzündungsreiz LPS und ihre Rolle bei der Aktivierung von Leukozyten und Haftung auf die vaskuläre Schicht vollständig zu charakterisieren. Die Endothelzellen Modell in dieser Handschrift wurde Lunge Endothelzellen Mauslinie (MLEC-04), wie von Hortelano Et Al. beschrieben 8. the MLEC-04-Zell-Linie in der Literatur soll ein geeignetes System, endotheliale Aktivierung9,10studieren validiert wurde. Basierend auf Forschungsinteressen, diese Ansätze können leicht extrapoliert werden zu jedem Endothelzellen oder Leukozyten Systeme und entzündlichen Profil. Sobald die endotheliale Parameter in den ausgewählten Bedingungen definiert sind, können das System neue Medikamente auf den vorgeschlagenen Experimente auszuwertende Kreislauf Aktivierung testen. Entzündlichen dabei die Endothel-Zellen getestet mit der Verbindung von Interesse können an die Kontrolle der Zellen verglichen werden, und alle sich daraus ergebenden Unterschiede informieren das Medikament prognostische Ergebnis auf Entwicklung und das Fortschreiten der Entzündung. Abschließend möchte ich sagen, schlagen wir einen relevanten System zur Charakterisierung neue Angriffspunkte, die Endothelzellen, die das Design neuartiger vaskulären-spezifische Therapien gegen entzündliche Erkrankungen beeinflussen können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Endothel Protokoll beschreibt eine schrittweise Technologie, die legt den Grundstein für die Erforschung neuartiger Mechanismen an der Regulation der Entzündungsreaktion beteiligt. Diese Ansätze basieren auf der Untersuchung der endothelialen Aktivität angeregt durch LPS und bewerten die entscheidenden Schritte, speziell bei der Rekrutierung von Leukozyten während der entzündlichen Reaktion beteiligt: endotheliale Cytokine Freigabe, endotheliale Haftung Moleküle Ausdruck und Leukozyten Adhäsion der vaskul?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von dem Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) und des Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (Grant-Nummer IERPY 1149/16, A.L.; MPY 1410/09, S. Hortelano); von der MINECO durch den Fondo de Investigación de Salud (FIS) (S. Hortelano Nummern PI11.0036 und PI14.0055 gewährt). S. Herranz wurde durch IERPY 1149/16 von ISCIII unterstützt.
Materials
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/ml |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/ml |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/ml |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/ml |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/ml |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/ml |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/ml |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/ml |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/ml |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/ml |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/ml |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/ml |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10000 |
References
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation?. Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
- Gerhardt, T., Ley, K. Monocyte trafficking across the vessel wall. Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).
- Andonegui, G., et al. Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection. J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).
- McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).
- Chamorro, &. #. 1. 9. 3. ;., Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).
- Hortelano, S. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).
- Palazón, A. Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).
- Jiménez-García, L. 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation. Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).
- . SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf (2013)
- Livak, K. J., Schmittge, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- . Pierce BCA Protein Assay Kit Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2017)
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
- . ImageJ User Guide Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf (2017)
- Hohsfield, L. A., Humpel, C. Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. PloS One. 10 (4), e0121930 (2015).
- Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening. Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Tedgui, A., Mallat, Z. Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall. Circ Res. 88 (9), 877-887 (2001).
- Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).
- Pripp, A. H., Stanišić, M. The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis. PloS One. 9 (2), e90149 (2014).
- Guha, M., Mackman, N. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).
- Tabas, I., Glass, C. K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science. 339 (6116), 166-172 (2013).
