Общая цель настоящего Протокола заключается в синтезировать функциональных Наносенсоры для портативных, экономически эффективным, и быстрое обнаружение конкретно болезнетворные бактерии через сочетание Магнитная релаксация и флуоресценции выбросов условий.
Энтерогеморрагические кишечной палочки O157: H7 был связан с оба водного и болезней пищевого происхождения, так и остается угрозой несмотря на методы отбора пищи и воды в настоящее время используется. Во время обычных бактериальных обнаружения методов таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и энзим соединенный иммуноферментного анализа (ИФА) конкретно может обнаружить патогенных загрязнителей, они требуют обширной пробоподготовки и длительных периодов ожидания. Кроме того эти методы требуют сложных лабораторных инструментов и параметров и должна выполняться квалифицированными специалистами. Здесь протокол предлагается для простой диагностики техника, которая имеет уникальное сочетание параметров магнитных и флуоресцентные в платформу на основе наночастиц. Предлагаемая многопараметрических магнито люминесцентные Наносенсоры (MFnS) можно обнаружить кишечной палочки O157: H7 загрязнения как 1 колонии формирование подразделения в раствор в течение менее 1 ч. Кроме того, MFnS способность оставаться весьма функциональный в сложных средах, таких как молоко и воды озера была проверена. Дополнительные специфика анализов использовались также для демонстрации способности MFnS только обнаружить конкретные целевые бактерий, даже при наличии аналогичных видов бактерий. Спаривание магнитных и люминесцентные методы позволяет для выявления и количественной оценки загрязнения возбудителя в широком диапазоне концентраций, экспонирования его высокая производительность в обоих ранней и поздней стадии обнаружения загрязнения. Эффективности, доступности и переносимости MFnS делают их идеальным кандидатом для точки обслуживания скрининга для бактериальных загрязнений в широком диапазоне параметров, от водных резервуаров для коммерчески упакованных пищевых продуктов.
Стойких возникновения бактериального загрязнения в оба коммерчески производства продуктов питания и источники воды создала потребность в более быстрых и конкретных диагностики платформ. 1 , 2 некоторые из более общих бактериальных загрязнений, ответственность за загрязнение пищи и воды, от сальмонеллы, стафилококки, Listeria, Vibrio, Shigella, родов Bacillus и Escherichia. 3 , 4 бактериального загрязнения этими патогенами часто приводит к симптомы, как лихорадка, холера, гастроэнтерит и понос. 4 загрязнение источников воды часто имеет радикальные и негативное воздействие на общины без доступа к достаточно фильтрованной воды, и загрязнение продуктов питания привела к большое количество заболеваний и усилия отозвания продукта. 5 , 6
Для того, чтобы уменьшить возникновение заболеваний, вызванных бактериального загрязнения, были ряд усилий по разработке методов, которыми воды и пищи можно эффективно сканировать до продажи или потребления. 3 методы, такие как ПЦР, ИФА,11,12 цикла опосредованной изотермической амплификация (1,7,8,9,10 ЛАМПА),14 13,среди прочего,15,16,,1718,19,20,21, 22,,2324 недавно были использованы для обнаружения различных возбудителей. По сравнению с традиционными бактериальных культивирования методов, эти методы являются гораздо более эффективным в отношении конкретности и время. Однако эти методы до сих пор борьба с ложных срабатываний и негативы, сложные процедуры и стоимость. 1 , 3 , 25 именно по этой самой причине, что многопараметрических магнито люминесцентные Наносенсоры (MFnS) предлагается как альтернативный метод для обнаружения бактерий.
Эти Наносенсоры уникально пара вместе Магнитная релаксация и люминесцентные методы, позволяя двойной обнаружения платформы, которая является быстрой и точной. Как пример загрязнения с помощью кишечной палочки O157: H7, свидетельствует MFnS способность обнаруживать кое как 1 в течение нескольких минут. Возбудитель специфические антитела используются для увеличения специфичности, и сочетание как магнитные, так и люминесцентные методы позволяет для обнаружения и количественного определения бактериальных загрязнений в обоих диапазонах низкого и высокого загрязнения. 16 в случае бактериального загрязнения, Наносенсоры будут роиться вокруг бактерии из-за ориентации способностей возбудителя специфических антител. Привязку между магнитным Наносенсоры и бактерии ограничивает взаимодействие между магнитным железное ядро и окружающие воды протонов. Это приводит к увеличению в T2 времени релаксации, как записано в магнитных релаксометр. Как повышается концентрация бактерий в растворе, Наносенсоры расходятся с увеличение количества бактерий, что приводит к более низкие значения T2. И наоборот флуоресценции выбросов будет увеличиваться пропорционально концентрации бактерий, в связи с увеличением числа Наносенсоры непосредственно привязаны к патогена. Центрифугирования образцов и изоляции бактериальной Пелле, только сохранит наночастиц, непосредственно подключенные к бактерии, удаление любого свободного плавающего Наносенсоры и непосредственно корреляция выбросов флуоресценции с числом бактерии, присутствующие в растворе. Схематическое представление этого механизма представлена на рисунке 1.
Эта платформа MFnS был разработан с точки обслуживания скрининга в виду, в результате характеристики лоу кост и портативный. MFnS стабильны при комнатной температуре и требуется только в очень низких концентрациях для точного обнаружения бактериальных загрязнений. Кроме того после синтеза, использование MFnS прост и не требует использования квалифицированных специалистов в этой области. Наконец это диагностическая платформа позволяет высоко настраиваемый ориентации, предоставляя средства, которых это одна платформа может использоваться для выявления возбудителей всех видов, в много различных настроек.
Этот протокол был разработан для получения полностью функциональной MFnS как просто как можно скорее. Однако есть много ключевых моментов, на которые изменения протокола может быть полезным, в зависимости от конечной цели пользователя. Например использование различны?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа поддерживается P20GM103418 K-INBRE, Канзас сои Комиссией (KSC/БП 1663), ACS PRF 56629-UNI7 и БП полимерной химии запуска фонда, все СС. Мы благодарим университета видеооператор, г-н Якоб Anselmi, за его выдающуюся работу с видео. Мы также благодарим г-н Роджер Heckert и миссис Катха Heckert за их щедрую поддержку для проведения исследований.
Ferrous Chloride Tetrahydrate | Fisher Scientific | I90-500 | |
Ferric Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | I88-500 | |
Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
Polyacryllic Acid | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
EDC | Thermofisher Scientific | 22980 | |
NHS | Fisher Scientific | AC157270250 | |
Anti-E. coli O111 antibody | sera care | 5310-0352 | |
Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6] | Abcam | ab75244 | |
DiI Stain | Fisher Scientific | D282 | |
Nutrient Broth | Difco | 233000 | |
Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet | ATCC | 700728 | |
Magnetic Relaxomteter | Bruker | mq20 | |
Zetasizer | Malvern | NANO-ZS90 | |
Plate Reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
Magnetic Column | QuadroMACS | 130-090-976 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804 Series | |
Centrifuge (accuSpin Micro 17) | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
Floor Model Shaking Incubator | SHEL LAB | SSI5 | |
Analytical Balance | Metler Toledo | ME104E | |
Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
Open-Air Rocking Shaker | Fisher Scientific | 02-217-765 |