L’objectif général du présent protocole est de synthétiser des nano-capteurs fonctionnels pour la portable, rentable, et une détection rapide des spécifiquement les bactéries pathogènes grâce à une combinaison de relaxation magnétique et modalités d’émission de fluorescence.
Entérohémorragique Escherichia coli O157 : H7 a été liée à la fois d’origine hydrique et les maladies d’origine alimentaire et reste une menace malgré les méthodes de dépistage-nourriture et eau utilisée actuellement. Tandis que les méthodes de détection bactérienne conventionnels, tels que la réaction en chaîne par polymérase (PCR) et les dosages immuno-enzymatiques (ELISA) peuvent détecter spécifiquement pathogènes contaminants, dont ils ont besoin préparation approfondie et longues périodes d’attente. En outre, ces pratiques demandent des instruments de laboratoire sophistiqué et paramètres et doivent être exécutés par des professionnels qualifiés. Dans les présentes, un protocole est proposé pour une simple technique de diagnostic qui offre la combinaison unique des paramètres magnétiques et fluorescentes dans une plateforme à base de nanoparticules. Le projet multiparamétriques magnéto-fluorescentes nano-capteurs (MFnS) permet de détecter la contamination e. coli O157 : H7 avec aussi peu que 1 unité formant colonie présente en solution dans moins de 1 h. En outre, la capacité de MFnS à rester très fonctionnel dans les milieux complexes tels que le lait et l’eau du lac a été vérifiée. Tests de spécificité supplémentaires ont aussi servis à démontrer la capacité de MFnS pour détecter uniquement les bactéries cibles précis, même en présence d’espèces de bactéries semblables. L’appariement des modalités magnétiques et fluorescentes permet la détection et la quantification de la contamination par des pathogènes dans un large éventail de concentrations, présentant ses performances élevées dans les deux détection de contamination et de tard-début. L’efficacité, l’abordabilité et portabilité de la MFnS rendent un candidat idéal pour le point-of-care dépistage contaminants bactériens dans un vaste éventail de contextes, de réservoirs aquatiques pour les aliments emballés dans le commerce.
La présence persistante de la contamination bactérienne dans les deux produit commercialement des produits alimentaires et des sources d’eau a créé un besoin pour les plateformes de diagnostics toujours plus rapides et plus précis. 1 , 2 certains des contaminants bactériens plus communs responsables de la contamination des aliments et l’eau sont des genres Salmonella, Staphylococcus, Listeria, Vibrio, Shigella, Bacillus et Escherichia. 3 , 4 la contamination bactérienne de ces agents pathogènes souvent se traduit par des symptômes tels que diarrhée, gastro-entérite, fièvre et choléra. 4 contamination des sources d’eau souvent a des effets drastiques et indésirables sur les communautés n’ont pas accès à l’eau suffisamment filtrée, et la contamination des aliments a conduit à un grand nombre de maladies et les efforts de rappel de produits. 5 , 6
Afin de réduire l’apparition de maladies dues à la contamination bactérienne, il y a eu un certain nombre d’efforts pour développer des méthodes par lequel l’eau et nourriture peuvent être efficacement scannés avant la vente ou la consommation. 3 techniques comme la PCR,1,7,8,9,10 ELISA,11,(12 ) amplification isotherme boucle-négociée LAMPE),13,14 parmi d’autres,15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24 a récemment utilisé pour la détection de pathogènes différents. Par rapport aux traditionnels bactéries cultivant des méthodes, ces techniques sont beaucoup plus efficaces en ce qui concerne la spécificité et l’heure. Toutefois, ces techniques se battent encore avec les faux positifs et négatifs, des procédures complexes et le coût. 1 , 3 , 25 c’est pour cette raison que multiparamétriques magnéto-fluorescentes nano-capteurs (MFnS) sont proposés comme une méthode alternative pour la détection bactérienne.
Ces Nano-capteurs paire unique ensemble relaxation magnétique et modalités fluorescentes, ce qui permet pour une plate-forme de détection de double qui est rapide et précise. La capacité de MFnS de détecter aussi peu que 1 UFC dans les minutes à l’aide d’e. coli O157 : H7 comme un contaminant de l’échantillon, est démontrée. Anticorps spécifiques sont utilisés pour augmenter la spécificité, et la combinaison des modalités magnétiques et fluorescentes permet la détection et la quantification des contaminants bactériens dans les deux gammes de basse et la haute-contamination. 16 dans le cas de contamination bactérienne, la nano-capteurs envahiront autour de la bactérie en raison de la capacité de ciblage des anticorps spécifiques. La liaison entre les bactéries et les nano-capteurs magnétiques limite l’interaction entre le noyau de fer magnétique et les protons de l’eau environnante. Cela entraîne une augmentation du temps de relaxation T2, telles qu’enregistrées par un relaxometer magnétique. Lorsque la concentration de bactéries en solution augmente, les nano-capteurs se dispersent avec la multiplication des bactéries, aboutissant à des valeurs plus faibles de T2. A l’inverse, émission de fluorescence augmentera proportionnellement à la concentration des bactéries, en raison de l’augmentation du nombre de nano-capteurs directement lié à l’agent pathogène. Centrifugation des échantillons et l’isolement de la pastille bactérienne, conservera uniquement les nanoparticules liés directement à la bactérie, supprimant toute nanodétecteurs flottant librement et directement corrélées avec le numéro de l’émission de fluorescence bactéries présentes dans la solution. Une représentation schématique de ce mécanisme est représentée dans la Figure 1.
Cette plate-forme MFnS a été conçue avec projection de point-of-care à l’esprit, ce qui entraîne des caractéristiques avantageuses et portables. MFnS sont stables à température ambiante et sont seulement tenus dans des concentrations très faibles pour la détection précise des contaminants bactériens. En outre, après synthèse, utilisation de la MFnS est simple et ne nécessite pas l’utilisation de professionnels formés dans le domaine. Enfin, cette plate-forme diagnostique permet un ciblage hautement personnalisable, fournissant un moyen par lequel cette une plate-forme unique peut être utilisée pour détecter des agents pathogènes de toutes sortes, dans de nombreux contextes différents.
Ce protocole a été conçu pour produire MFnS entièrement fonctionnel aussi simplement que possible. Cependant, il y a beaucoup de points clés au cours de laquelle l’altération du protocole peut être utile, selon l’objectif final de l’utilisateur. Par exemple, l’utilisation de différents anticorps permettrait de ciblage de nombreux autres agents pathogènes. En outre, ce protocole n’est pas limité à l’utilisation d’anticorps comme ciblant les molécules. N’importe …
The authors have nothing to disclose.
Ce travail est soutenu par K-INBRE P20GM103418, Kansas soja Commission (KSC/PSU 1663), ACS PRF 56629-UNI7 et PSU polymère chimie démarrage fonds, tous à la SS. Nous remercions le vidéaste de l’Université, M. Jacob Anselmi, pour son excellent travail avec la vidéo. Nous remercions également M. Roger Heckert et Mme Katha Heckert pour leur généreux soutien à la recherche.
Ferrous Chloride Tetrahydrate | Fisher Scientific | I90-500 | |
Ferric Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | I88-500 | |
Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
Polyacryllic Acid | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
EDC | Thermofisher Scientific | 22980 | |
NHS | Fisher Scientific | AC157270250 | |
Anti-E. coli O111 antibody | sera care | 5310-0352 | |
Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6] | Abcam | ab75244 | |
DiI Stain | Fisher Scientific | D282 | |
Nutrient Broth | Difco | 233000 | |
Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet | ATCC | 700728 | |
Magnetic Relaxomteter | Bruker | mq20 | |
Zetasizer | Malvern | NANO-ZS90 | |
Plate Reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
Magnetic Column | QuadroMACS | 130-090-976 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804 Series | |
Centrifuge (accuSpin Micro 17) | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
Floor Model Shaking Incubator | SHEL LAB | SSI5 | |
Analytical Balance | Metler Toledo | ME104E | |
Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
Open-Air Rocking Shaker | Fisher Scientific | 02-217-765 |