Summary

Pathogènes d’origine alimentaire préalable à l’aide de magnéto-fluorescent NANOCAPTEUR : Détection rapide d’e. Coli O157 : H7

Published: September 17, 2017
doi:

Summary

L’objectif général du présent protocole est de synthétiser des nano-capteurs fonctionnels pour la portable, rentable, et une détection rapide des spécifiquement les bactéries pathogènes grâce à une combinaison de relaxation magnétique et modalités d’émission de fluorescence.

Abstract

Entérohémorragique Escherichia coli O157 : H7 a été liée à la fois d’origine hydrique et les maladies d’origine alimentaire et reste une menace malgré les méthodes de dépistage-nourriture et eau utilisée actuellement. Tandis que les méthodes de détection bactérienne conventionnels, tels que la réaction en chaîne par polymérase (PCR) et les dosages immuno-enzymatiques (ELISA) peuvent détecter spécifiquement pathogènes contaminants, dont ils ont besoin préparation approfondie et longues périodes d’attente. En outre, ces pratiques demandent des instruments de laboratoire sophistiqué et paramètres et doivent être exécutés par des professionnels qualifiés. Dans les présentes, un protocole est proposé pour une simple technique de diagnostic qui offre la combinaison unique des paramètres magnétiques et fluorescentes dans une plateforme à base de nanoparticules. Le projet multiparamétriques magnéto-fluorescentes nano-capteurs (MFnS) permet de détecter la contamination e. coli O157 : H7 avec aussi peu que 1 unité formant colonie présente en solution dans moins de 1 h. En outre, la capacité de MFnS à rester très fonctionnel dans les milieux complexes tels que le lait et l’eau du lac a été vérifiée. Tests de spécificité supplémentaires ont aussi servis à démontrer la capacité de MFnS pour détecter uniquement les bactéries cibles précis, même en présence d’espèces de bactéries semblables. L’appariement des modalités magnétiques et fluorescentes permet la détection et la quantification de la contamination par des pathogènes dans un large éventail de concentrations, présentant ses performances élevées dans les deux détection de contamination et de tard-début. L’efficacité, l’abordabilité et portabilité de la MFnS rendent un candidat idéal pour le point-of-care dépistage contaminants bactériens dans un vaste éventail de contextes, de réservoirs aquatiques pour les aliments emballés dans le commerce.

Introduction

La présence persistante de la contamination bactérienne dans les deux produit commercialement des produits alimentaires et des sources d’eau a créé un besoin pour les plateformes de diagnostics toujours plus rapides et plus précis. 1 , 2 certains des contaminants bactériens plus communs responsables de la contamination des aliments et l’eau sont des genres Salmonella, Staphylococcus, Listeria, Vibrio, Shigella, Bacillus et Escherichia. 3 , 4 la contamination bactérienne de ces agents pathogènes souvent se traduit par des symptômes tels que diarrhée, gastro-entérite, fièvre et choléra. 4 contamination des sources d’eau souvent a des effets drastiques et indésirables sur les communautés n’ont pas accès à l’eau suffisamment filtrée, et la contamination des aliments a conduit à un grand nombre de maladies et les efforts de rappel de produits. 5 , 6

Afin de réduire l’apparition de maladies dues à la contamination bactérienne, il y a eu un certain nombre d’efforts pour développer des méthodes par lequel l’eau et nourriture peuvent être efficacement scannés avant la vente ou la consommation. 3 techniques comme la PCR,1,7,8,9,10 ELISA,11,(12 ) amplification isotherme boucle-négociée LAMPE),13,14 parmi d’autres,15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24 a récemment utilisé pour la détection de pathogènes différents. Par rapport aux traditionnels bactéries cultivant des méthodes, ces techniques sont beaucoup plus efficaces en ce qui concerne la spécificité et l’heure. Toutefois, ces techniques se battent encore avec les faux positifs et négatifs, des procédures complexes et le coût. 1 , 3 , 25 c’est pour cette raison que multiparamétriques magnéto-fluorescentes nano-capteurs (MFnS) sont proposés comme une méthode alternative pour la détection bactérienne.

Ces Nano-capteurs paire unique ensemble relaxation magnétique et modalités fluorescentes, ce qui permet pour une plate-forme de détection de double qui est rapide et précise. La capacité de MFnS de détecter aussi peu que 1 UFC dans les minutes à l’aide d’e. coli O157 : H7 comme un contaminant de l’échantillon, est démontrée. Anticorps spécifiques sont utilisés pour augmenter la spécificité, et la combinaison des modalités magnétiques et fluorescentes permet la détection et la quantification des contaminants bactériens dans les deux gammes de basse et la haute-contamination. 16 dans le cas de contamination bactérienne, la nano-capteurs envahiront autour de la bactérie en raison de la capacité de ciblage des anticorps spécifiques. La liaison entre les bactéries et les nano-capteurs magnétiques limite l’interaction entre le noyau de fer magnétique et les protons de l’eau environnante. Cela entraîne une augmentation du temps de relaxation T2, telles qu’enregistrées par un relaxometer magnétique. Lorsque la concentration de bactéries en solution augmente, les nano-capteurs se dispersent avec la multiplication des bactéries, aboutissant à des valeurs plus faibles de T2. A l’inverse, émission de fluorescence augmentera proportionnellement à la concentration des bactéries, en raison de l’augmentation du nombre de nano-capteurs directement lié à l’agent pathogène. Centrifugation des échantillons et l’isolement de la pastille bactérienne, conservera uniquement les nanoparticules liés directement à la bactérie, supprimant toute nanodétecteurs flottant librement et directement corrélées avec le numéro de l’émission de fluorescence bactéries présentes dans la solution. Une représentation schématique de ce mécanisme est représentée dans la Figure 1.

Cette plate-forme MFnS a été conçue avec projection de point-of-care à l’esprit, ce qui entraîne des caractéristiques avantageuses et portables. MFnS sont stables à température ambiante et sont seulement tenus dans des concentrations très faibles pour la détection précise des contaminants bactériens. En outre, après synthèse, utilisation de la MFnS est simple et ne nécessite pas l’utilisation de professionnels formés dans le domaine. Enfin, cette plate-forme diagnostique permet un ciblage hautement personnalisable, fournissant un moyen par lequel cette une plate-forme unique peut être utilisée pour détecter des agents pathogènes de toutes sortes, dans de nombreux contextes différents.

Protocol

1. synthèse et fonctionnalisation de multi paramétrique magnéto-fluorescentes nano-capteurs (MFnS). Synthèse de superparamagnetic iron oxide nanoparticles (IONPs) à préparer pour la synthèse IONP, préparer les 3 solutions suivantes : Solution 1 : FeCl 3 0,70 g et FeCl 2 H 2 O (2 mL), Solution 2 : NH 4 OH (2,0 mL, 13,4 M) H 2 O (15 mL) et 3 Solution : acide polyacrylique (0,855 g) H 2 O (5 mL). Ajouter 90 µL de 2 …

Representative Results

Le mécanisme d’action MFnS est représenté dans la Figure 1. Le regroupement des MFnS autour de la surface des contaminants bactériens interfère avec les interactions entre les noyaux de la MFnS et les noyaux d’hydrogène environnant. À la suite de cette relaxation clustering, magnétique, les valeurs augmentent. Augmentation de la concentration de contaminants bactériens, clustering réduit, et le changement des valeurs de T2 diminue. Par conséquent, l’ajout d’une modalité f…

Discussion

Ce protocole a été conçu pour produire MFnS entièrement fonctionnel aussi simplement que possible. Cependant, il y a beaucoup de points clés au cours de laquelle l’altération du protocole peut être utile, selon l’objectif final de l’utilisateur. Par exemple, l’utilisation de différents anticorps permettrait de ciblage de nombreux autres agents pathogènes. En outre, ce protocole n’est pas limité à l’utilisation d’anticorps comme ciblant les molécules. N’importe …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail est soutenu par K-INBRE P20GM103418, Kansas soja Commission (KSC/PSU 1663), ACS PRF 56629-UNI7 et PSU polymère chimie démarrage fonds, tous à la SS. Nous remercions le vidéaste de l’Université, M. Jacob Anselmi, pour son excellent travail avec la vidéo. Nous remercions également M. Roger Heckert et Mme Katha Heckert pour leur généreux soutien à la recherche.

Materials

Ferrous Chloride Tetrahydrate Fisher Scientific I90-500
Ferric Chloride Hexahydrate Fisher Scientific I88-500
Ammonium Hydroxide Fisher Scientific A669S-500
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144S-500
Polyacryllic Acid Sigma-Aldrich 323667-100G
EDC Thermofisher Scientific 22980
NHS Fisher Scientific AC157270250
Anti-E. coli O111 antibody  sera care 5310-0352
Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6]  Abcam ab75244
DiI Stain Fisher Scientific D282
Nutrient Broth Difco 233000
Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet ATCC 700728
Magnetic Relaxomteter  Bruker mq20
Zetasizer Malvern NANO-ZS90
Plate Reader  Tecan Infinite M200 PRO
Magnetic Column  QuadroMACS 130-090-976
Centrifuge Eppendorf 5804 Series
Centrifuge (accuSpin Micro 17) Fisher Scientific 13-100-676
Floor Model Shaking Incubator SHEL LAB SSI5
Analytical Balance Metler Toledo ME104E
Digital Vortex Mixer Fisher Scientific 02-215-370
Open-Air Rocking Shaker Fisher Scientific 02-217-765

References

  1. Law, J. W., Ab Mutalib, N. S., Chan, K. G., Lee, L. H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front Microbiol. 5, 770 (2014).
  2. Pandey, P. K., Kass, P. H., Soupir, M. L., Biswas, S., Singh, V. P. Contamination of water resources by pathogenic bacteria. AMB Express. 4, 51 (2014).
  3. Zhao, X., Lin, C. W., Wang, J., Oh, D. H. Advances in rapid detection methods for foodborne pathogens. J Microbiol Biotechnol. 24 (3), 297-312 (2014).
  4. Heithoff, D. M., et al. Intraspecies variation in the emergence of hyperinfectious bacterial strains in nature. PLoS Pathog. 8 (4), e1002647 (2012).
  5. Ishii, S., Sadowsky, M. J. Escherichia coli in the Environment: Implications for Water Quality and Human Health. Microbes Environ. 23 (2), 101-108 (2008).
  6. Chiou, C. S., Hsu, S. Y., Chiu, S. I., Wang, T. K., Chao, C. S. Vibrio parahaemolyticus serovar O3:K6 as cause of unusually high incidence of food-borne disease outbreaks in Taiwan from 1996 to 1999. J Clin Microbiol. 38 (12), 4621-4625 (2000).
  7. Zhou, G., et al. PCR methods for the rapid detection and identification of four pathogenic Legionella spp. and two Legionella pneumophila subspecies based on the gene amplification of gyrB. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 777-787 (2011).
  8. Chen, J., Tang, J., Liu, J., Cai, Z., Bai, X. Development and evaluation of a multiplex PCR for simultaneous detection of five foodborne pathogens. J Appl Microbiol. 112 (4), 823-830 (2012).
  9. LeBlanc, J. J., et al. Switching gears for an influenza pandemic: validation of a duplex reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection and confirmatory identification of pandemic (H1N1) 2009 influenza virus. J Clin Microbiol. 47 (12), 3805-3813 (2009).
  10. Mahony, J. B., Chong, S., Luinstra, K., Petrich, A., Smieja, M. Development of a novel bead-based multiplex PCR assay for combined subtyping and oseltamivir resistance genotyping (H275Y) of seasonal and pandemic H1N1 influenza A viruses. J Clin Virol. 49 (4), 277-282 (2010).
  11. Alvarez, M. M., et al. Specific recognition of influenza A/H1N1/2009 antibodies in human serum: a simple virus-free ELISA method. PLoS One. 5 (4), e10176 (2010).
  12. Huang, C. J., Dostalek, J., Sessitsch, A., Knoll, W. Long-range surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy biosensor for ultrasensitive detection of E. coli O157:H7. Anal Chem. 83 (3), 674-677 (2011).
  13. Zhang, J., et al. Rapid visual detection of highly pathogenic Streptococcus suis serotype 2 isolates by use of loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol. 51 (10), 3250-3256 (2013).
  14. Han, F., Wang, F., Ge, B. Detecting potentially virulent Vibrio vulnificus strains in raw oysters by quantitative loop-mediated isothermal amplification. Appl Environ Microbiol. 77 (8), 2589-2595 (2011).
  15. Wang, J., et al. Rapid detection of pathogenic bacteria and screening of phage-derived peptides using microcantilevers. Anal Chem. 86 (3), 1671-1678 (2014).
  16. Banerjee, T., et al. Multiparametric Magneto-fluorescent Nanosensors for the Ultrasensitive Detection of Escherichia coli O157:H7. ACS Infect Dis. 2 (10), 667-673 (2016).
  17. Shelby, T., et al. Novel magnetic relaxation nanosensors: an unparalleled "spin" on influenza diagnosis. Nanoscale. 8, 19605-19613 (2016).
  18. Bui, M. P., Ahmed, S., Abbas, A. Single-Digit Pathogen and Attomolar Detection with the Naked Eye Using Liposome-Amplified Plasmonic Immunoassay. Nano Lett. 15 (9), 6239-6246 (2015).
  19. Farnleitner, A. H., et al. Rapid enzymatic detection of Escherichia coli contamination in polluted river water. Lett Appl Microbiol. 33 (3), 246-250 (2001).
  20. Huh, Y. S., Lowe, A. J., Strickland, A. D., Batt, C. A., Erickson, D. Surface-enhanced Raman scattering based ligase detection reaction. J Am Chem Soc. 131 (6), 2208-2213 (2009).
  21. Jayamohan, H., et al. Highly sensitive bacteria quantification using immunomagnetic separation and electrochemical detection of guanine-labeled secondary beads. Sensors (Basel). 15 (5), 12034-12052 (2015).
  22. Kaittanis, C., Naser, S. A., Perez, J. M. One-step, nanoparticle-mediated bacterial detection with magnetic relaxation. Nano Lett. 7 (2), 380-383 (2007).
  23. Meeker, D. G., et al. Synergistic Photothermal and Antibiotic Killing of Biofilm-Associated Staphylococcus aureus Using Targeted Antibiotic-Loaded Gold Nanoconstructs. ACS Infect Dis. 2 (4), 241-250 (2016).
  24. Wang, Y., Ye, Z., Si, C., Ying, Y. Subtractive inhibition assay for the detection of E. coli O157:H7 using surface plasmon resonance. Sensors (Basel). 11 (3), 2728-2739 (2011).
  25. Zhao, X., et al. A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (42), 15027-15032 (2004).

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Shelby, T., Sulthana, S., McAfee, J., Banerjee, T., Santra, S. Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7. J. Vis. Exp. (127), e55821, doi:10.3791/55821 (2017).

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