Vasküler Endotelyal Kök Hücrelerin Damar Oluşumunu Görselleştirmek İçin Yeni Bir Göğüs Göğsü Transplantasyon Tekniği
Summary
Bu çalışma, mikroskopik gözlem için tüm montaj dokusu hazırlığının ardından meme yağ padi transplantasyonu yoluyla vasküler endotel kök hücrelerinin (VESC'lerin) çoğalmasını, farklılaşmasını ve damar oluşturma potansiyelini değerlendirmek için yeni bir yaklaşımı göstermektedir. VESC'lerin in vivo davranışlarını araştırmak için bir soy izleme stratejisi de sunulmuştur.
Abstract
Endotel hücreleri (AK) vasküler mimarisinin temel yapı taşlarıdır ve uygun damar gelişimini ve homeostazı sağlamak için vasküler büyümeye ve yeniden şekillenmeye aracılık eder. Bununla birlikte, endotelyal soy hiyerarşisi üzerine yapılan çalışmalar, erişim kazanma araçlarının eksikliği ve davranışlarını doğrudan in vivo olarak değerlendirmeleri nedeniyle hala kaçınılmazdır. Bu eksikliği gidermek için meme yağ pedini kullanarak anjiyogenezi incelemek için yeni bir doku modeli geliştirildi. Memeli bezi, ergenlik ve gebelik de dahil olmak üzere doğum sonrası evrelerde gelişirken, bu süreçte sağlam epitel çoğalması geniş damar tadilatıyla birlikte gerçekleşir. Meme yağ yastıkları, büyüyen meme epitelinden alan, matris ve zengin anjiyojenik uyaranlar sağlar. Dahası, meme yağ padleri peritoneal boşluğun dışında bulunur ve bu sayede ekzojen hücrelerin anjiyojenik potansiyelini değerlendirmek için kolayca erişilebilir bir aşılama alanı haline getirilir. Bu çalışma ayrıca,Vivo endotel kök hücre hedefli popülasyonunu (VESC'ler) in vivo olarak özel olarak etiketlemek için floresan muhabir farelerini kullanan nt izlem yaklaşımı. Bu soy takibi yöntemi, daha sonra doku bütün montaj mikroskopisi ile birleştiğinde, çoğalma kapasitesinin ölçülebileceği ve farklılaşma taahhüdünün kader eşleştirilebileceği hedeflenen hücrelerin ve torunlarının doğrudan görselleştirilmesini sağlar. Bu yöntemleri kullanarak, VESC'leri ifade eden iki kutuplu protein C reseptör (Procr) popülasyonu son zamanlarda birçok vasküler sistemde tanımlanmıştır. Procr + VESC'ler hem yeni EC'lere hem de perisitlere neden olarak, gelişme, homeostaz ve hasar onarımı sırasında anjiogenezise aktif olarak katkıda bulunurlar. Genel olarak, bu el yazması VESC'lerin kök hücre özelliklerini değerlendirmek için kullanılabilecek yeni bir göğüs yağ padi transplantasyonunu ve canlı organizma izleme tekniğini tanımlamaktadır.
Introduction
Gelişme ve homeostaz sırasında, vasküler büyüme ve yeniden şekillendirme, organ gelişimine ve onarımı uyarınca sadık kalarak gerçekleşir. Anjiyogenez, mevcut kan damarlarından yeni damarların oluşumunu açıklar ve bu dinamik vasküler değişikliklere aracılık eden önemli bir kuvvet olarak kabul edilir. Her kan damarı, bir dizi endotel hücresi (EC) ile astarlanmış olup, bunlar gemi yapısının temelini oluşturmuş gibi görünmektedir. Uzun süre, homeostaz sırasında EC havuzunun doldurulması mekanizması belirsiz kaldı ve vasküler ciro, olgunlaşan AT çoğalmasının bir sonucu olup olmadığı veya vasküler kök / progenitör hücre aktivitelerinin katkısı olup olmadığı üzerine tartışmalar yapıldı. Doğrudan fizyolojik kanıt bulunmaması nedeniyle, vasküler endotelyal kök hücrelerin (VESC'ler) varlığı ve hücresel kimliğini de tartışmalı olarak kaldı.
Kök hücre davranışını doğrulamak için kullanılan en yaygın yaklaşımlardan biri transplanstan geçmektedirFarazi kök hücrelerin alıcı farelere tayin edilmesi. Bu yöntem, aday kök hücrelerin köklenme potansiyelini in vivo olarak ölçer . Transplantasyon ilk hematopoietik sistem 2 hiyerarşik özellikleri kurulmasına katkıda kemik iliği kök hücrelerinin 1, çalışma uygulanmıştır. Endotel sahasında, yan deri altına subkutan yoldan sokulan bir bazal membran matrisi ( ör., Matrigel) tıpası, nakledilen EC'lerin damar oluşum yeteneklerini ele alan standart bir in vivo anjiyogenez tahlilidir. 3D kültür sistemlerinde koloni oluşumu ve transplantasyon da dahil olmak üzere çok sayıda deneysel yöntem, EC progenitörü / VESC popülasyonunda 3 , 4 , 5 , 6'yı önermişlerdir. Bununla birlikte, bazal membran matrisine gömülü EC'ler,Çevredeki doku, bu, nakledilen hücrelerin anjiyojenik potansiyelini tam olarak keşfetmek için gerekli en uygun niş ortamı sağlamaz. Sonuç olarak, matris tıpası içerisinde oluşan kaplar ağırlıklı olarak kılcal benzeri olup fonksiyonel olarak ölçülemezdirler.
Memeli bezi postnatal dönemde gelişir, en sağlam büyüme ergenlik ve gebelik sırasında gerçekleşir. Ergenlik evresinde, meme epiteli tüm meme yastığını işgal etmek için hızlı genişlemeye, çevredeki vasküler yapıların etkili şekilde yeniden şekillenmesine eşlik eder. Böylece, meme bezi anjiyogenez çalışması için mükemmel bir model sunar. Uzanan meme epitelinden boşluk, matris ve zengin anjiyojenik uyaranlar sağlar ve bu nedenle ekzojen hücrelerin anjiyojenik potansiyelini değerlendirmek için ideal bir aşılama alanıdır. Buna ek olarak, meme yağ yastığı, oluşturulan eksojen damarların ev sahibi dolaşım sistemi ile entegrasyonunu sağlar ve daha fazla fTek dereceli değerlendirme ve subkutan transplantasyona kıyasla bir avantaj sağlamaktadır.
In vitro kültürleme ve transplantasyon tahlilleri, bir hücre popülasyonunun rejenerasyon özelliklerini araştırmak için etkili bir yol olmasına rağmen , hücrelerin doğal yaşam alanlarından uzaklaştırıldıklarında bu tahlillerin plastisiteyi uyardığı bilinir ve hücreler koparsa değişiklikler meydana gelebilir Fizyolojik çevreleri 7 . Dolayısıyla, doğrudan in vivo hücre akıbetiyle ilgili kanıt elde etmek, endotel popülasyonlarının mevcut davranış anlayışının geliştirilmesine yönelik temel yaklaşımdır.
VESC'lerin tanımlanması ve vücut sistemindeki özelliklerinin incelenmesi için, fizyolojik bağlamında in vivo kök hücre davranışını ortaya koyabileceği ve gerçek köklenme olabileceği için genetik kader haritalaması zorunludur ( örn., In vivo soy travması) değerlendirdi. Lineage traciNG, aday VESC'lerin uzun süreli kalıcılığının ( örn. Kendiliğinden yenilenmesi) ve orijin dokusu için hücre tipleri üretme kabiliyetinin ( yani, farklılaşma potensi) doğrudan kanıtını sağlar.
Bu protokol, yeni bir meme yağ padi transplantasyon tekniğini ve VESC'lerin damar üretim yeteneğini gözlemlemek için bir soy travma metodunu açıklamaktadır. Bu teknikler mevcut testlerin eksikliklerinin üstesinden gelir ve VESC'lerin kök hücre özelliklerini en iyi şekilde değerlendirmenin yeni bir yolunu sağlar. Bu yaklaşımlar, patolojik bir ortamda vasküler hücre potens alterasyonunu belirlemenin yanı sıra, endotel popülasyonlarının damar oluşum özelliklerini ve davranışı değerlendirmek için kullanılabilecek etkili araçlardır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anjiyogenez tahlilleri, vasküler dinamiklerin çalışılması için iyi bir deneysel yaklaşımı temsil eder. Postnatal olarak gelişen fare retinal vaskülatürü, anjiyogenezi incelemek için çekici bir model olduğu kanıtlanmıştır 12 . Nispeten erişilebilir olmasına rağmen, retina vasküler yatağı içinde fiili manipülasyon oldukça zordur. Şimdiye kadar, en iyi tarif edilen in vivo transplantasyon, bir bazal membran matriks kütlesi içindeki hücreleri kapsayan ve bir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (315030045 ve 31371500, YAZ için 31401245, QCY için 31401245), Çin Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (2014CB964800), Çin Bilimler Akademisi (XDB19000000 ila YAZ) ve Çinli Hücre Biyolojisi Derneği (QCY'ye Erken Kariyer Bursu).
Materials
| 0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1X) | Gibco (Life Technologies) | 25300-062 | 0.05% Trypsin |
| 0.22 µm Filter Unit | Merck Millipore Ltd. | SLGP033RB | 0.22 µm Filter |
| 2-Methylbutanol-2, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | 24, 048-6 | Tert Amyl Alcohol |
| 222, Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25g | 222, Tribromethanol |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) | Invitrogen | D1306 | DAPI |
| 70 µm Cell Strainer | BD FAL | 352350 | 70 µm Cell Strainer |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 188105 | Glass slides |
| Anti-mouse CD105 APC | eBioscience | 17-1051-82, clone MJ7/18 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| Anti-mouse CD201 Biotin | eBioscience | 13-2012-82 | for FACS analusis use at 2.5 µg/mL |
| Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7 | eBioscience | 25-0311-82, clone 390 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| BD FACSJazz Cell Sorter | BD Biosciences | 655489 | FACS |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 100190332 | BSA |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Centrifuge |
| Collagenase type 3 | Worthington-Biochem | #LS004183 | Collagenase III |
| Confocal microscopy | Leica | sp8 | Confocal |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D2463-5VL | Dnase I |
| Donkey anti-Rat Cy3 | Jackson ImmunResearch | 712-165-150 | Secondary antibody, use at 0.5 µg/mL |
| Dumont Forceps | WPI | 500342 | Froceps |
| Dumont Forceps – Micro-Blunted Tips | FST | 11253-20 | Forceps |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | FBS |
| FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119 | BioLegend | 78022 | Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 µl per test |
| Glycerol | Sigma | G6279 | Glycerol |
| Iscov's Modified Dulbecco's Medium | Gibco (Life Technologies) | 12440-053 | IMDM |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora 647 | Invitrogen | Z32450 | Isolectin-647 |
| Matrigel Matrix (growth factor reduced) | BD | 356231 | Matrigel |
| Mouse strain (Actin-GFP) | Jax Laboratories | 3773 | Actin-GFP |
| Mouse strain (C57BL/6) | SLAC | C57BL/6 | C57BL/6 |
| Mouse strain (BALB/c nude) | SLAC | BALB/c nude | Nude mice |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | PFA |
| Penicilin Streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 5140-122 | Pen/Strep |
| Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1X | Gibco (Life Technologies) | c20012500BT | PBS |
| PRIM1640 | Gibco (Life Technologies) | c11875500CP | PRIM1640 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | Mounting Medium |
| Rat anti CD144 | BD Biosciences | 550548 | for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 µg/mL |
| Rat anti CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 ug/mL |
| Red Cell Lysis Buffer | Sigma | R7767-100ML | Red blood cell lysing buffer |
| Straight/Sharp-Blunt/10cm | FST | 14028-10 | Fine Scissors |
| Streptavidin eFluor 450 | eBioscience | 48-4317-82 | for FACS analysis use at 0.5 µg/mL |
| Tamoxifen | Sigma | 101551374 | TAM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | TritonX |
| Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle) | COVIDIEN | S1173 | Suture |
| Sterile Disposable Scaplels | Swann Morton | #10 | Scalpel |
| Betadine | Yifeng Medical | 20160101 | Antiseptic solution |
References
- Thomas, E. D., Lochte, H. L., Lu, W. C., Ferrebee, J. W. Intravenous infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy. N Engl J Med. 257 (11), 491-496 (1957).
- Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).
- Bompais, H., et al. Human endothelial cells derived from circulating progenitors display specific functional properties compared with mature vessel wall endothelial cells. Blood. 103 (7), 2577-2584 (2004).
- Fang, S., Wei, J., Pentinmikko, N., Leinonen, H., Salven, P. Generation of functional blood vessels from a single c-kit+ adult vascular endothelial stem cell. PLoS Biol. 10 (10), e1001407 (2012).
- Naito, H., Kidoya, H., Sakimoto, S., Wakabayashi, T., Takakura, N. Identification and characterization of a resident vascular stem/progenitor cell population in preexisting blood vessels. EMBO J. 31 (4), 842-855 (2012).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Snippert, H. J., Clevers, H. Tracking adult stem cells. Embo Rep. 12 (2), 113-122 (2011).
- Yu, Q. C., Song, W., Wang, D., Zeng, Y. A. Identification of blood vascular endothelial stem cells by the expression of protein C receptor. Cell Res. 26 (10), 1079-1098 (2016).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506, 322-327 (2014).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Wang, D. S., et al. Identification of multipotent mammary stemcells by protein C receptor expression. Nature. 517, 81-U201 (2015).
- Stahl, A., et al. The Mouse Retina as an Angiogenesis Model. Invest Ophth Vis Sci. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Mammoto, T., Mammoto, A. Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis. J. Vis. Exp. (94), e52012 (2014).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17 (6), 849-860 (2009).
