Een nieuwe Mammary Fat Pad Transplantation Technique om de Vessel Generation van Vasculaire Endotheliale Stamcellen te visualiseren
Summary
Dit werk demonstreert een nieuwe aanpak om het proliferatie-, differentiatie- en vaartuigvormende potentieel van vasculaire endotheliale stamcellen (VESC's) te beoordelen door middel van transpiratie van de dikke dikvliesvoeding, gevolgd door een full-mount weefselbereiding voor microscopische observatie. Ook wordt een lineage-tracingsstrategie om het gedrag van VESC's in vivo te onderzoeken, ook voorgesteld.
Abstract
Endotheelcellen (EC's) zijn de fundamentele bouwstenen van de vasculaire architectuur en bemiddelen van vasculaire groei en remodeling om de juiste ontwikkeling van het vaartuig en homeostase te waarborgen. Echter, studies over de endotheliale afstammingshiërarchie blijven onduidelijk wegens het gebrek aan hulpmiddelen om toegang te krijgen en hun gedrag in vivo direct te evalueren. Om deze tekortkoming aan te pakken, is een nieuw weefselmodel ontwikkeld om angiogenese te bestuderen met behulp van het vetpadschuim. De borstklier ontwikkelt zich meestal in de postnatale stadia, waaronder puberteit en zwangerschap, gedurende welke robuuste epithelium proliferatie gepaard gaat met uitgebreide vasculaire remodeling. Mammary fat pads bieden ruimte, matrix en rijke angiogene stimuli uit het groeiende mammary epithelium. Bovendien bevinden zich dikke vetpadsjes buiten de peritoneale holte, waardoor ze een gemakkelijk toegankelijke inplantingsplaats zijn voor het beoordelen van het angiogene potentieel van exogene cellen. Dit werk beschrijft ook een efficiëntieNt tracing benadering met behulp van fluorescerende reporter muizen om specifiek de doelgroep van vasculaire endotheliale stamcellen (VESCs) in vivo te meten. Deze afstammingsmethode, gekoppeld aan de daaropvolgende microscopie van het weefsel, maakt de directe visualisatie van gerichte cellen en hun nakomelingen mogelijk, waardoor de proliferatiecapaciteit kan worden gekwantificeerd en de differentiatieverbintenis kan worden vastgelegd. Met behulp van deze methoden is onlangs een populatie van bipotente proteïne C-receptor (Procr) die VESC's uitdrukt, geïdentificeerd in meerdere vasculaire systemen. Procr + VESCs, die aanleiding geven tot zowel nieuwe EC's als pericytes, actief bijdragen tot angiogenese tijdens de ontwikkeling, homeostase en herstel van letsels. In het algemeen beschrijft dit manuscript een nieuwe transplantatie van de dikke dikke padtransplantatie en in vivo lineage tracing technieken die kunnen worden gebruikt om de stamcel eigenschappen van VESCs te evalueren.
Introduction
Tijdens ontwikkeling en homeostase vinden vasculaire groei en remodeling trouwen plaats in overeenstemming met orgaantengroei en reparatie. Angiogenese beschrijft de opkomst van nieuwe vaten van bestaande bloedvaten en wordt beschouwd als een belangrijke kracht die deze dynamische vasculaire veranderingen bemiddelt. Elk bloedvat is binnenkant met een laag endotheliale cellen (EC's), en ze lijken de basis te zijn van de vaartuigarchitectuur. Het mechanisme waardoor de EC-pool tijdens de homeostase is aangevuld, bleef lang en onduidelijk, en er werden argumenten aangevoerd over de vraag of vasculaire omzet het gevolg is van volwassen EC proliferatie of is de bijdrage van vasculaire stam- / stamcellenactiviteiten. Door het gebrek aan direct fysiologisch bewijs bleef het bestaan en de cellulaire identiteit van vasculaire endotheel stamcellen (VESC's) ook controversieel.
Een van de meest voorkomende benaderingen die gebruikt worden om het gedrag van stamcellen te verifiëren, is via het transplanTation van vermeende stamcellen in ontvanger muizen. Deze methode meet het stamme potentieel van kandidaat stamcellen in vivo. Transplantatie werd eerst toegepast op het onderzoek van beenmergstamcellen 1 , die bijgedragen heeft tot de vaststelling van de hiërarchische kenmerken van het hematopoietische systeem 2 . In het endotheel veld, een basaalmembraan matrix (bv Matrigel) plug subcutaan ingebracht onder de huid flank een standaard in vivo angiogenese assay toegepast om de bloedvatvorming mogelijkheden van getransplanteerde EC pakken. Veelvoudige experimentele methoden, waaronder kolonievorming in 3D-cultuursystemen en transplantatie, hebben potentiële EC-stamvogens / VESC-populaties 3 , 4 , 5 , 6 voorgesteld. Echter, aangezien EC's ingebed in basismembraanmatrix relatief gescheiden zijn vanHet omliggende weefsel biedt dit niet de optimale nicheomgeving die nodig is om het angiogene potentieel van getransplanteerde cellen volledig te onderzoeken. Als gevolg daarvan zijn vaten die in de matrixplug zijn gevormd overwegend capillaireachtig en functioneel onmetelijk.
De borstkanker ontwikkelt postnataal, met de meest robuuste groei die zich voordoet tijdens puberteit en zwangerschap. In het pubertalische stadium ondergaat het mammary epithelium een snelle expansie, om het hele dikke vetpadsysteem in te nemen, vergezeld van een efficiënte remodellering van de omliggende vasculaire structuren. Zo biedt de borstklier een uitstekend model voor de studie van angiogenese. Het biedt ruimte, matrix en rijke angiogene stimuli uit het groeiende mammary epithelium en is daarom een ideale transplantatieplaats voor het beoordelen van het angiogene potentieel van exogene cellen. Daarnaast maakt het vetvoet van het mammarium de gevormde exogene vaten mogelijk te integreren met het gastheercirculatiesysteem, waardoor verdere f mogelijk wordt gemaaktUnctionele evaluatie en een voordeel over subcutane transplantatie.
Hoewel in vitro- kweek- en transplantatietesten even doeltreffend zijn om de regeneratie-eigenschappen van een celpopulatie te onderzoeken, is het bekend dat dergelijke analyses plasticiteit kunnen stimuleren als cellen weggenomen worden van hun natieve habitats en veranderingen kunnen worden geïnduceerd wanneer cellen worden losgekoppeld van Hun fysiologische omgeving 7 . Daarom is het verkrijgen van direct in vivo bewijs van celfate de sleutelbenadering om het huidige begrip van het gedrag van endotheelbevolkingen te bevorderen.
Genetische kaartvorming ( dwz in vivo lineage tracing) is essentieel voor de identificatie van VESC's en voor het onderzoek van hun eigenschappen in het lichaamsysteem, omdat het in vivo stamcellen gedrag in zijn fysiologische context kan onthullen en de werkelijke stevigheid kan zijn beoordeeld. Lineage traciNg biedt direct bewijs van de langdurige persistentie ( dwz zelfvernieuwing) van kandidaat-VESC's en hun vermogen om celtypen voor het weefsel van oorsprong te produceren ( dwz differentiatiekracht).
Dit protocol beschrijft een nieuwe transplantatietechniek voor mammary fat pad transplantatie en een lineage traceringsmethode om het vaartuiggeneratievermogen van VESC's te waarnemen. Deze technieken overwinnen tekortkomingen van momenteel beschikbare analyses en bieden een nieuwe manier om de stamcel eigenschappen van VESCs optimaal te evalueren. Deze benaderingen zijn efficiënte hulpmiddelen die kunnen worden gebruikt om het gedrag en de vaatvormende eigenschappen van endotheelbevolkingen te beoordelen, evenals om veranderingen in de vasculaire celsterkte binnen een pathologische omgeving te bepalen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Angiogenese analyses vormen een goede experimentele benadering om vasculaire dynamiek te bestuderen. Muis-retinale vasculatuur, die postnataal ontwikkelt, blijkt een aantrekkelijk model te zijn om angiogenese 12 te bestuderen. Ondanks het feit dat het relatief toegankelijk is, is de feitelijke manipulatie binnen het retina-vaatstelsel nogal moeilijk. Tot nu toe is de best omschreven in vivo transplantatie de proefanalyse uitgevoerd, die cellen in een matrix van de basismembraan en chirur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Nationale Natuurwetenschappenstichting van China (31530045 en 31371500 naar YAZ, 31401245 naar QCY), het ministerie van Wetenschap en Technologie van China (2014CB964800), de Chinese Academie van Wetenschappen (XDB19000000 tot YAZ) en de Chinese Samenleving van Celbiologie (Early Career Fellowship to QCY).
Materials
| 0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1X) | Gibco (Life Technologies) | 25300-062 | 0.05% Trypsin |
| 0.22 µm Filter Unit | Merck Millipore Ltd. | SLGP033RB | 0.22 µm Filter |
| 2-Methylbutanol-2, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | 24, 048-6 | Tert Amyl Alcohol |
| 222, Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25g | 222, Tribromethanol |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) | Invitrogen | D1306 | DAPI |
| 70 µm Cell Strainer | BD FAL | 352350 | 70 µm Cell Strainer |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 188105 | Glass slides |
| Anti-mouse CD105 APC | eBioscience | 17-1051-82, clone MJ7/18 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| Anti-mouse CD201 Biotin | eBioscience | 13-2012-82 | for FACS analusis use at 2.5 µg/mL |
| Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7 | eBioscience | 25-0311-82, clone 390 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| BD FACSJazz Cell Sorter | BD Biosciences | 655489 | FACS |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 100190332 | BSA |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Centrifuge |
| Collagenase type 3 | Worthington-Biochem | #LS004183 | Collagenase III |
| Confocal microscopy | Leica | sp8 | Confocal |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D2463-5VL | Dnase I |
| Donkey anti-Rat Cy3 | Jackson ImmunResearch | 712-165-150 | Secondary antibody, use at 0.5 µg/mL |
| Dumont Forceps | WPI | 500342 | Froceps |
| Dumont Forceps – Micro-Blunted Tips | FST | 11253-20 | Forceps |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | FBS |
| FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119 | BioLegend | 78022 | Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 µl per test |
| Glycerol | Sigma | G6279 | Glycerol |
| Iscov's Modified Dulbecco's Medium | Gibco (Life Technologies) | 12440-053 | IMDM |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora 647 | Invitrogen | Z32450 | Isolectin-647 |
| Matrigel Matrix (growth factor reduced) | BD | 356231 | Matrigel |
| Mouse strain (Actin-GFP) | Jax Laboratories | 3773 | Actin-GFP |
| Mouse strain (C57BL/6) | SLAC | C57BL/6 | C57BL/6 |
| Mouse strain (BALB/c nude) | SLAC | BALB/c nude | Nude mice |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | PFA |
| Penicilin Streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 5140-122 | Pen/Strep |
| Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1X | Gibco (Life Technologies) | c20012500BT | PBS |
| PRIM1640 | Gibco (Life Technologies) | c11875500CP | PRIM1640 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | Mounting Medium |
| Rat anti CD144 | BD Biosciences | 550548 | for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 µg/mL |
| Rat anti CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 ug/mL |
| Red Cell Lysis Buffer | Sigma | R7767-100ML | Red blood cell lysing buffer |
| Straight/Sharp-Blunt/10cm | FST | 14028-10 | Fine Scissors |
| Streptavidin eFluor 450 | eBioscience | 48-4317-82 | for FACS analysis use at 0.5 µg/mL |
| Tamoxifen | Sigma | 101551374 | TAM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | TritonX |
| Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle) | COVIDIEN | S1173 | Suture |
| Sterile Disposable Scaplels | Swann Morton | #10 | Scalpel |
| Betadine | Yifeng Medical | 20160101 | Antiseptic solution |
References
- Thomas, E. D., Lochte, H. L., Lu, W. C., Ferrebee, J. W. Intravenous infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy. N Engl J Med. 257 (11), 491-496 (1957).
- Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).
- Bompais, H., et al. Human endothelial cells derived from circulating progenitors display specific functional properties compared with mature vessel wall endothelial cells. Blood. 103 (7), 2577-2584 (2004).
- Fang, S., Wei, J., Pentinmikko, N., Leinonen, H., Salven, P. Generation of functional blood vessels from a single c-kit+ adult vascular endothelial stem cell. PLoS Biol. 10 (10), e1001407 (2012).
- Naito, H., Kidoya, H., Sakimoto, S., Wakabayashi, T., Takakura, N. Identification and characterization of a resident vascular stem/progenitor cell population in preexisting blood vessels. EMBO J. 31 (4), 842-855 (2012).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Snippert, H. J., Clevers, H. Tracking adult stem cells. Embo Rep. 12 (2), 113-122 (2011).
- Yu, Q. C., Song, W., Wang, D., Zeng, Y. A. Identification of blood vascular endothelial stem cells by the expression of protein C receptor. Cell Res. 26 (10), 1079-1098 (2016).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506, 322-327 (2014).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Wang, D. S., et al. Identification of multipotent mammary stemcells by protein C receptor expression. Nature. 517, 81-U201 (2015).
- Stahl, A., et al. The Mouse Retina as an Angiogenesis Model. Invest Ophth Vis Sci. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Mammoto, T., Mammoto, A. Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis. J. Vis. Exp. (94), e52012 (2014).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17 (6), 849-860 (2009).
