Kronik Lenfositik Lösemi Hastalarında Metil-CpG-Bağlayıcı Alan Yakalamaya Dayalı Bir Yöntem Kullanarak Kapsamlı DNA Metilasyon Analizi
Summary
Bu çalışma, kronik lenfositik lösemi (KL) hastalarında farklı şekilde metilasyona uğramış CpG bakımından zengin bölgelerin tanımlanması için optimize edilmiş bir metil-CpG-bağlanma alanı (MBD) sıralama protokolünü ve bir hesaplama hattını açıklamaktadır.
Abstract
Kansere karşı uzun kodlamayan RNA'ların (lncRNA'lar) rolü, kanser gelişiminde ve ilerlemesinde mekanik işlevlerinin anlaşılmasına olan artan ilgiden ötürü ön plana çıkmaktadır. Buna rağmen, lncRNA'ların global epigenetik düzenlenmesi ve kanserdeki tekrarlayıcı sekanslar, özellikle kronik lenfositik lösemi (CLL) 'de iyi araştırılmamıştır. Bu çalışma, benzersiz bir yaklaşım üzerinde yoğunlaşmaktadır: metil bağlanma alanı (MBD) proteinleri kullanılarak çift sarmallı, metillenmiş DNA fragmanlarının immüno çökeltme bazlı yakalanması, bunu takiben yeni nesil sıralama (MBD-seq). Bu çalışmada iki prognostik alt gruba (5 IGVH mutasyonlu numuneye + 5 IGVH mutasyona uğramamış örnek) ait CLL hasta örnekleri kullanılmıştır. Analiz, normal sağlıklı kontrollerle karşılaştırıldığında 5,800 hipermetilatlı ve 12,570 hipometillenmiş CLL-spesifik diferansiyel metillenmiş geni (cllDMGs) ortaya çıkarmıştır. Daha da önemlisi, bu sonuçlar farklı CLL'ye spesifik, farklı şekilde metillenmiş lncRNA'ları tanımladı.Petitive elementleri ve potansiyel prognostik değeri olan protein kodlayan genleri içerir. Bu çalışma, CLL hasta numunelerini kullanarak CpG bakımından zengin bölgelerde küresel metilasyon profillerinin kapsamlı analizi için geliştirilen bir MBD-seq ve biyoinformatik boru hattı için ayrıntılı bir protokolün ana hatlarını çizmektedir. Son olarak, bir protein kodlayıcı gen ve bir lncRNA, MBD-seq protokolünden elde edilen bulguları daha da desteklemek için CpG metilasyon seviyelerini analiz etmek için oldukça nicel bir yöntem olan pirozleme kullanılarak doğrulandı.
Introduction
Küresel DNA metilasyon profillerini analiz etmek için yeni nesil sıralama tekniklerinin kullanılması son yıllarda giderek daha fazla popüler olmuştur. Genetik DNA'nın bisülfit dönüşümü, metilasyona duyarlı kısıtlama enzimi sindirimleri ve metil CpG'ye spesifik antikorlar kullanılarak metilatlanmış DNA'nın immüno-çökeltilmesi, mikroarray ve mikroarray esaslı olmayan yöntemler de dahil olmak üzere genom çapında metilasyon tahlilleri geliştirildi .
Vahşi DNA metilasyonu, lösemi ve lenfomaların, kronik lenfositik lösemi (CLL) de dahil olmak üzere en belirgin özelliklerinden biridir. Daha önceleri, bizimkileri de içeren birkaç grup, farklı CLL prognostik alt gruplarının DNA metilasyon profillerini ve genomik DNA'nın bisülfit dönüşümünü kullanan normal, sağlıklı B-hücresi kontrollerini, bunu takiben mikro dizi tabanlı metotlar veya tüm genom dizilişi 1 , 2 , 3 ile karakterize edildi. , <Sup class = "xref"> 4. Genomik DNA'nın bisülfit dönüşümü, değiştirilmemiş sitozinlerin urasile deamine edilmesine ve değiştirilmiş metillenmiş sitozinlerin genomda kalmasına neden olur. Dönüştürüldükten sonra, DNA'nın metilasyon durumu, PCR amplifikasyonu ve mikro dizi tabanlı veya bütün genom bisülfit sıralama (WGBS) gibi farklı nicel veya nitel yöntemler kullanılarak sıralama ile belirlenebilir. Bisülfit dönüşüm esaslı yöntemlerin birçok avantajı olmasına ve DNA metilasyon düzeylerini analiz etmek için farklı kanser türlerinde yaygın olarak kullanılmasına rağmen, bu teknikle ilgili birkaç sakınca vardır. WGBS sıralama, daha düşük DNA miktarlarıyla tekli baz çiftli çözünürlüğe izin verir ve çok sayıda numuneyi analiz etmek için en uygun seçenektir. Bununla birlikte, bu yöntem genomda 5 mC ve 5 hmC seviyeleri arasındaki modifikasyonları ayırt etmeyi başaramamaktadır 5 , 6 . Ek olarak, mikro-dizi tabanlı yöntemler tam cGenomun fazlalığı.
Laboratuvarımızda yapılan yeni bir çalışmada, KLL'li hastalarda ve normal sağlıklı kontrollerde yüksek oranda CpG açısından zengin, diferansiyel olarak metillenmiş bölgelerin global ölçekte tanımlanması için bisülfit dönüşümünden ziyade immüno-çökeltiye dayalı yöntemler kullanılmıştır. Inmethyl-CpG-binding domain (MBD) yeni nesil sıralama (MBD-seq), çift sarmallı parçalanmış DNA'nın zenginleştirilmesi CpG metilasyon derecesine bağlıdır. Bu yöntem, bisülfit dönüştürme yönteminin dezavantajlarının üstesinden gelebilir ve aynı zamanda, PCR ve bağımsız bir şekilde biseksüel ve PCR ile bağımsız olarak CpG metilasyonunu kapsar. Bisülfit dönüşümlü mikroarray yöntemlerinden farklı olarak, MBD-seq, uzun serpiştirilmiş nükleer elementler (LINEs), kısa serpilmiş nükleer elementler (SINE'lar), uzun terminal tekrarları (LTRS) gibi tekrarlayan elementlerin metilasyon durumunu analiz etmek için kullanılabilir. Vb . Bununla birlikte, bisülfit dönüşüm yöntemlerine kıyasla,Bir MBD-seq protokolü nispeten büyük miktarda giriş DNA'sı gerektirir. Ayrıca, sekanslama kalitesini okur ve veriler, kullanılan antikorların özgüllüğüne, afinitesine ve kalitesine bağlıdır.
Mevcut çalışma, yeni nesil sıralama için metillenmiş DNA'yı zenginleştirmek için ayrıntılı bir MBD-seq protokolünü açıklıyor. Normal sağlıklı kontrollerle karşılaştırıldığında CLL'ye özgü hiper-ve hipometillenmiş bölgeleri tanımlamak için metilasyon dizilimi verilerini görselleştirmek ve yorumlamak için hesaplanmış bir boru hattı yanında ticari bir metillenmiş DNA bağlayıcı zenginleştirme kiti (Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir) kullanır. Temel olarak, bu metot, metillenmiş CpG'ler ile zenginleştirilmiş DNA'yı çıkarmak için metilleştirilen CpG'ler ile insan MBD2 proteini etkileşiminin MBD'sinin kabiliyetini kullanır ve bunu metilasyon DNA'sının yüksek verimli sekanslama izler.
Protocol
Representative Results
Discussion
MBD-seq, genom çapında kapsamlı kapsama alanı ile metilasyon modellerini incelemek için kullanılabilecek, maliyet etkin, immüno çökeltme tabanlı bir tekniktir. Hem MeDIP sekansı (metilleştirilen DNA immüno çökeltme, ardından dizilim) ve MBD-seq, CpG bakımından zengin metillenmiş DNA'yı zenginleştirir. Bununla birlikte, MBD-seq, MeDIP sekansı 19 ile karşılaştırıldığında yüksek CpG-zengin bölgelerine bağlanma yönünde daha fazla afinite göstermektedir. Bir met…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, İsveç Araştırma Konseyi, İsveç Kanser Topluluğu, Knut ve Alice Wallenberg Vakfı (KAW) ve FoU VästraGötalandsregionen tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Dneasy Blood and tissue kit | Qaigen | 69504 | |
| Lymphoprep solution | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
| Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE buffer PH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor standard sonication device | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX bioruptor tubes 1.5ml | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M Sodium acetate | Diagenode | C03030002 | |
| E-gel iBase safe imager combo kit | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-gel 2% Agarose gels | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| Methylminer Methylated DNA enrichment kit | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake Tube Shaker/Rotators | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| Vortex mixer | VWR | 12620-848 | |
| Absolute Ethanol | Any company | ||
| 70% Ethanool | Any company | ||
| DNAse free water | Milli Q | ||
| DNA precipitant (3M sodium acetate) | Diagenode | C03030002 | |
| Safe seal 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5ml tubes | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
| Water Bath | Grant | ||
| Heat block | grant | ||
| Tube rotater | Labquake |
References
- Kanduri, M., et al. Differential genome-wide array-based methylation profiles in prognostic subsets of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 115 (2), 296-305 (2010).
- Cahill, N., et al. 450K-array analysis of chronic lymphocytic leukemia cells reveals global DNA methylation to be relatively stable over time and similar in resting and proliferative compartments. Leukemia. 27 (1), 150-158 (2013).
- Kanduri, M., et al. Distinct transcriptional control in major immunogenetic subsets of chronic lymphocytic leukemia exhibiting subset-biased global DNA methylation profiles. Epigenetics. 7 (12), 1435-1442 (2012).
- Kulis, M., et al. Epigenomic analysis detects widespread gene-body DNA hypomethylation in chronic lymphocytic leukemia. Nat Genet. 44 (11), 1236-1242 (2012).
- Booth, M. J., et al. Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution. Science. 336 (6083), 934-937 (2012).
- Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149 (6), 1368-1380 (2012).
- Subhash, S., Andersson, P. O., Kosalai, S. T., Kanduri, C., Kanduri, M. Global DNA methylation profiling reveals new insights into epigenetically deregulated protein coding and long noncoding RNAs in CLL. Clin Epigenetics. 8, 106 (2016).
- Hallek, M., et al. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 guidelines. Blood. 111 (12), 5446-5456 (2008).
- De Meyer, T., et al. Quality evaluation of methyl binding domain based kits for enrichment DNA-methylation sequencing. PLoS One. 8 (3), e59068 (2013).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Subhash, S., Kanduri, C. GeneSCF: a real-time based functional enrichment tool with support for multiple organisms. BMC Bioinformatics. 17 (1), 365 (2016).
- Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Martinelli, S., et al. ANGPT2 promoter methylation is strongly associated with gene expression and prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Epigenetics. 8 (7), 720-729 (2013).
- Kopparapu, P. K., et al. Epigenetic silencing of miR-26A1 in chronic lymphocytic leukemia and mantle cell lymphoma: Impact on EZH2 expression. Epigenetics. 11 (5), 335-343 (2016).
- Robinson, M. D., et al. Evaluation of affinity-based genome-wide DNA methylation data: effects of CpG density, amplification bias, and copy number variation. Genome Res. 20 (12), 1719-1729 (2010).
