Summary

Комплексный анализ метилирования ДНК с использованием метода Methyl-CpG-связывающего домена для захвата у пациентов с хронической лимфоцитарной лейкемией

Published: June 16, 2017
doi:

Summary

В этой работе описывается оптимизированный протокол секвенирования доменов с меченным CpG-связывающим доменом (MBD) и вычислительный конвейер для идентификации дифференцированных метилированных CpG-богатых областей у пациентов с хронической лимфоцитарной лейкемией (CLL).

Abstract

Роль длинных некодирующих РНК (lncRNAs) в раке выходит на первый план из-за растущего интереса к пониманию их механистических функций при развитии рака и его прогрессировании. Несмотря на это, глобальная эпигенетическая регуляция lncRNAs и повторяющихся последовательностей в раке не была хорошо исследована, особенно при хронической лимфоцитарной лейкемии (CLL). В этом исследовании основное внимание уделяется уникальному подходу: взятие иммунопреципитации двухцепочечных метилированных фрагментов ДНК с использованием белков с метиловым связыванием (MBD) с последующим секвенированием следующего поколения (MBD-seq). В этом исследовании использовались образцы пациентов с ХЛЛ, принадлежащие двум прогностическим подгруппам (5 мутантных образцов ИГВХ + 5 безмолекулярных образцов IGVH). Анализ выявил 5800 гиперметилированных и 12 570 гипометилированных CLL-специфических дифференцированных метилированных генов (cllDMG) по сравнению с нормальными здоровыми контролями. Важно отметить, что эти результаты выявили несколько CLL-специфических, дифференцированных метилированных lncRNAs, reМелкие элементы и белок-кодирующие гены с потенциальной прогностической ценностью. В этой работе описывается подробный протокол для трубопровода MBD-seq и биоинформатики, разработанный для всестороннего анализа глобальных профилей метилирования в богатых CpG областях с использованием образцов пациентов CLL. Наконец, ген, кодирующий белок, и lncRNA были проверены с использованием пиросеквенирования, который является высоко количественным методом для анализа уровней метилирования CpG для дальнейшего подтверждения результатов протокола MBD-seq.

Introduction

Использование технологий последующего секвенирования для анализа глобальных профилей метилирования ДНК в последние годы пользуется все большей популярностью. Анализы метилирования в масштабе всего генома, включая методы на основе микрочипов и не микрочипов, были разработаны на основе следующего: бисульфитная конверсия геномной ДНК, чувствительность к метилированию рестрикционных ферментов и иммунопреципитация метилированной ДНК с использованием метил-CpG-специфических антител ,

Метилирование ДНК аберранта является одним из признаков лейкемии и лимфом, включая хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ). Ранее несколько групп, в том числе наши, характеризовали профили метилирования ДНК различных прогностических подгрупп CLL и нормальные здоровые B-клеточные контрольные группы с использованием бисульфитной конверсии геномной ДНК с последующими методами на основе микро-матрицы или секвенированием цельного генома 1 , 2 , 3 , <Sup class = "xref"> 4. Бисульфитная конверсия геномной ДНК приводит к дезаминированию немодифицированных цитозинов к урацилу, оставляя модифицированные метилированные цитозины в геноме. После преобразования статус метилирования ДНК может быть определен с помощью ПЦР-амплификации и секвенирования с использованием различных количественных или качественных методов, таких как бисульфитное секвенирование на основе микроячейки или цельного генома (WGBS). Хотя методы, основанные на использовании бисульфита, имеют много преимуществ и широко используются в разных типах рака для анализа уровней метилирования ДНК, есть несколько недостатков, связанных с этим методом. Секвенирование WGBS позволяет разрешать однобазовую пару с меньшим количеством ДНК и является наилучшим подходящим вариантом для анализа большого количества образцов. Однако этот метод не позволяет дифференцировать модификации между уровнями 5 мК и 5 hmC в геноме 5 , 6 . Кроме того, методы на основе микрочипов не предлагают полного cИзбыток генома.

В недавнем исследовании из нашей лаборатории 7 методы, основанные на иммунопреципитации, а не конверсия бисульфита, были использованы для идентификации высококонцентрированных, дифференцированных метилированных областей CpG в глобальном масштабе у пациентов с ХЛЛ и нормального здорового контроля. Секвенирование следующего поколения inmethyl-CpG-связывающего домена (MBD) (MBD-seq), обогащение двухцепочечной фрагментированной ДНК зависит от степени метилирования CpG. Этот способ может преодолеть недостатки метода конверсии бисульфита и может также обеспечить общий охват генотипированием CpG в геноме несмещенным и ПЦР-независимым образом. Кроме того, в отличие от методов микрочипов на основе конверсии на основе бисульфита, MBD-seq может использоваться для анализа статуса метилирования повторяющихся элементов, таких как длинные вкрапленные ядерные элементы (LINE), короткие вкрапленные ядерные элементы (SINE), длинные концевые повторы (LTRS) И т.д. Однако по сравнению с методами конверсии бисульфита,Для протокола MBD-seq требуется относительно большое количество входной ДНК. Кроме того, качество чтения последовательности и данные зависят от специфичности, сродства и качества используемых антител.

В настоящем исследовании объясняется подробный протокол MBD-seq для обогащения метилированной ДНК для секвенирования следующего поколения. Он использует коммерческий набор метилированного ДНК-связывающего обогащения ( указанный в Таблице материалов ), а также вычислительный трубопровод для визуализации и интерпретации данных секвенирования метилирования для определения специфичных к ХЛЛ гипер- и гипометилированных областей по сравнению с нормальным здоровым контролем. В принципе, этот метод использует способность MBD взаимодействия человеческого белка MBD2 с метилированными CpG для экстракции ДНК, обогащенной метилированными CpG, и за этим следует высокопроизводительное секвенирование метилированной ДНК.

Protocol

Этическое утверждение для сбора образцов ХЛЛ осуществляется с 2007-05-21, со следующим регистрационным номером: EPN Gbg dnr 239/07. Все пациенты с ХЛЛ были диагностированы в соответствии с недавно пересмотренными критериями 8 , и образцы были собраны во время диагностики. Пациенты в ис…

Representative Results

MBD-seq недавно был проведен на пациентах с ХЛЛ и соответствовал нормальным здоровым элементам управления, чтобы идентифицировать дифференцированные ХЛЛ дифференциально гипер- и гипометилированные гены. Экспериментальный и биоинформационный трубопровод, используемы…

Discussion

MBD-seq является экономически эффективным методом иммунопреципитации, который может быть использован для изучения образцов метилирования с полным охватом генома. И MeDIP seq (метилированная ДНК-иммунопреципитация с последующим секвенированием), и MBD-seq приводят к обогащению обогащенной CpG-м?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано Шведским исследовательским советом, Шведским онкологическим обществом, Фондом Кнут и Алисой Валленбергом (KAW) и FoU VästraGötalandsregionen.

Materials

Dneasy Blood and tissue kit Qaigen 69504
Lymphoprep solution A X I S-S H I E L D 1114544
Nano drop 2000 Thermo Fischersceintific
TE buffer PH 8 Sigma aldrich 93283
Bioruptor standard sonication device Diagenode UCD-200
TPX bioruptor tubes 1.5ml Diagenode C30010010-300
3 M Sodium acetate Diagenode C03030002
E-gel iBase safe imager combo kit Thermo Fischersceintific G6465EU
E-gel 2% Agarose gels Thermo Fischersceintific G441002
Methylminer Methylated DNA enrichment kit Thermo Fischersceintific ME10025
Labquake Tube Shaker/Rotators Thermo Fischersceintific 415110
Dynal MPC-S Thermo Fischersceintific A13346
Vortex mixer VWR 12620-848
Absolute Ethanol Any company
70% Ethanool Any company
DNAse free water Milli Q
DNA precipitant (3M sodium acetate) Diagenode C03030002
Safe seal 1.5ml eppendorf tubes Eppendorf 4036-3204
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fischersceintific Q32851
Qubit 0.5ml tubes Thermo Fischersceintific Q32856
Qubit Thermo Fischersceintific Q32866
Illumina Hiseq2000 Platform Illumina
Water  Bath Grant
Heat block grant
Tube rotater Labquake

References

  1. Kanduri, M., et al. Differential genome-wide array-based methylation profiles in prognostic subsets of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 115 (2), 296-305 (2010).
  2. Cahill, N., et al. 450K-array analysis of chronic lymphocytic leukemia cells reveals global DNA methylation to be relatively stable over time and similar in resting and proliferative compartments. Leukemia. 27 (1), 150-158 (2013).
  3. Kanduri, M., et al. Distinct transcriptional control in major immunogenetic subsets of chronic lymphocytic leukemia exhibiting subset-biased global DNA methylation profiles. Epigenetics. 7 (12), 1435-1442 (2012).
  4. Kulis, M., et al. Epigenomic analysis detects widespread gene-body DNA hypomethylation in chronic lymphocytic leukemia. Nat Genet. 44 (11), 1236-1242 (2012).
  5. Booth, M. J., et al. Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution. Science. 336 (6083), 934-937 (2012).
  6. Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149 (6), 1368-1380 (2012).
  7. Subhash, S., Andersson, P. O., Kosalai, S. T., Kanduri, C., Kanduri, M. Global DNA methylation profiling reveals new insights into epigenetically deregulated protein coding and long noncoding RNAs in CLL. Clin Epigenetics. 8, 106 (2016).
  8. Hallek, M., et al. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 guidelines. Blood. 111 (12), 5446-5456 (2008).
  9. De Meyer, T., et al. Quality evaluation of methyl binding domain based kits for enrichment DNA-methylation sequencing. PLoS One. 8 (3), e59068 (2013).
  10. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  11. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
  12. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  13. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  14. Subhash, S., Kanduri, C. GeneSCF: a real-time based functional enrichment tool with support for multiple organisms. BMC Bioinformatics. 17 (1), 365 (2016).
  15. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
  16. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  17. Martinelli, S., et al. ANGPT2 promoter methylation is strongly associated with gene expression and prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Epigenetics. 8 (7), 720-729 (2013).
  18. Kopparapu, P. K., et al. Epigenetic silencing of miR-26A1 in chronic lymphocytic leukemia and mantle cell lymphoma: Impact on EZH2 expression. Epigenetics. 11 (5), 335-343 (2016).
  19. Robinson, M. D., et al. Evaluation of affinity-based genome-wide DNA methylation data: effects of CpG density, amplification bias, and copy number variation. Genome Res. 20 (12), 1719-1729 (2010).

Play Video

Cite This Article
Subhash, S., Kanduri, M. Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients. J. Vis. Exp. (124), e55773, doi:10.3791/55773 (2017).

View Video