Summary

ניתוח מקיף מתילציה DNA באמצעות Methyl-CpG מחייב דומיין לכידת מבוסס שיטה בחולים לוקמיה לימפוציטית כרונית

Published: June 16, 2017
doi:

Summary

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול רצף של methyl-cpG-bonding (MBD) של פרוטוקול רצף וציר חישובי, כדי לזהות אזורים עשירים ב- CpG באופן דיפרנציאלי בחולי לוקמיה כרונית של לימפוציטים (CLL).

Abstract

תפקידם של RNAs ארוך noncoding (lncRNAs) בסרטן מגיע לחזית עקב העניין הגובר בהבנת הפונקציות המכניסטיות שלהם במהלך התפתחות סרטן התקדמות. למרות זאת, הרגולציה האפיגנטית העולמית של lncRNAs ורצפים חוזרים בסרטן לא נחקרה היטב, במיוחד בלוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL). מחקר זה מתמקד בגישה ייחודית: הלכידה המבוססת על immunoprecipitation של שברי דנ"א דו-תקועים, מתילציה, באמצעות חלבונים מסוג Methyl-bond (MBD), ואחריהם רצף הדור הבא (MBD-seq). דגימות CLL המשתייכות לשתי קבוצות משנה פרוגנוסטיות (5 IGVH דגימות מוטציה + 5 IGVH דגימות unmutated) שימשו במחקר זה. ניתוח גילה 5,800 hypermethylated ו 12,570 hypomethylated CLL ספציפיים דיפרנציאלי methylated גנים (cllDMGs) לעומת בקרות בריא נורמלי. חשוב לציין, תוצאות אלה זיהו מספר CLL ספציפי, lncRNAs methylated דיפרנציאלי, מחדשאלמנטים חיוניים, וגנים המקודדים חלבונים בעלי ערך פרוגנוסטי פוטנציאלי. עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול מפורט עבור צינור MBD-seq ו bioinformatics שפותח עבור ניתוח מקיף של פרופילים מתילציה העולמי באזורים CpG עשיר מאוד באמצעות דגימות החולים CLL. לבסוף, גן מקודד חלבון ו- lncRNA אומתו באמצעות pyrosequencing, שהיא שיטה כמותית מאוד לנתח את רמות מתילציה CpG כדי לאשש את הממצאים מן הפרוטוקול MBD-seq.

Introduction

השימוש בטכניקות רצף הדור הבא לנתח פרופילים מתילציה דנ"א גלובלי כבר יותר ויותר פופולרי בשנים האחרונות. גנום רחב מבחני מתילציה, כולל microarray- ולא מבוססי שיטות microarray, פותחו על בסיס הבאות: המרה bisulfite של DNA גנומי, מתילציה רגיש הגבלת אנזים עיכול, ואת immunoprecipitation של דנ"א מתילציה באמצעות מתיל CpG ספציפי נוגדנים .

מתילציה של דנ"א סוטה היא אחד מסימני ההיכר של לוקמיה ולימפומות, לוקמיה לימפוציטית כוללנית (CLL). מוקדם יותר, כמה קבוצות, כולל שלנו מאופיינים פרופילים מתילציה DNA של קבוצות שונות CLL פרוגנוסטי נורמלי, בריא B- שולטת תאים באמצעות המרה bisulfite של DNA גנומי, ואחריו מיקרו מבוססי מערך שיטות או כל גנום רצף 1 , 2 , 3 , <Sup class = "xref"> 4. המרה bisulfite של הדנ"א הגנומי מוביל deamination של ציטוזינים ללא שינוי כדי uracil, עוזב את ציטוסינים methylated שונה בגנום. לאחר המרה, מצב מתילציה של ה- DNA יכול להיקבע על ידי הגברה PCR ו רצף בשיטות כמותיות או איכותיות שונות, כגון מיקרו מבוסס מערך מבוסס או כל הגנום bisulfite רצף (WGBS). למרות bisulfite שיטות מבוססות המרה יש יתרונות רבים נמצאים בשימוש נרחב סוגים שונים של סרטן לנתח את רמות מתילציה DNA, יש כמה חסרונות הקשורים בטכניקה זו. רצף WGBS מאפשר רזולוציה בסיסית עם זוג אחד עם כמויות נמוכות יותר של DNA והוא האפשרות המתאימה ביותר לניתוח מספר גדול של דגימות. עם זאת, שיטה זו אינה מבדילה את השינויים בין 5 mC ו 5 רמות hmc בגנום 5 , 6 . בנוסף, שיטות מבוססות microarray לא מציעים להשלים גיתר על המידה של הגנום.

במחקר שנערך לאחרונה במעבדה שלנו 7 , שיטות immunoprecipitation מבוסס, ולא המרה bisulfite, שימשו לזהות מאוד CpG עשיר, דיפרנציאלי methylated אזורים בקנה מידה עולמי בחולים CLL ובריאים בריא שולט. Inmethyl-CpG- מחייב תחום (MBD) הדור הבא רצף (MBD-seq), העשרה של DNA מקוטעת כפול תקועים תלוי במידת מתילציה CpG. שיטה זו יכולה להתגבר על החסרונות של שיטת המרה bisulfite והוא יכול גם לספק כיסוי גנום רחב של מתילציה CpG בצורה בלתי משוחדת ו- PCR עצמאית. בנוסף, בניגוד לשיטות microarray המבוססות על המרה המבוססות על bisulfite, ניתן להשתמש ב- MBD-seq כדי לנתח את מצב המתילציה של אלמנטים חוזרים, כגון אלמנטים גרעיניים ארוכים (LINE), אלמנטים גרעיניים קצרים (SINE), חוזי מסוף ארוכים (LTRS) וכו ' . עם זאת, לעומת שיטות המרה bisulfite,פרוטוקול MBD-seq דורש כמות גדולה יחסית של קלט DNA. כמו כן, איכות רצף קורא את הנתונים תלויים הספציפיות, זיקה, ואיכות של נוגדנים בשימוש.

המחקר הנוכחי מסביר פרוטוקול מפורט MBD-Seq להעשרת דנ"א methylated עבור הדור הבא רצף. היא משתמשת methylated דנ"א העשרה העשרה קיט (המפורטים בטבלה חומרים ), כמו גם צינור חישובית לדמיין ולפרש נתונים רצף מתילציה לזהות CLL ספציפיים היפר ו- hypomethylated אזורים לעומת בקרות בריאים נורמליים. ביסודו של דבר, שיטה זו עושה שימוש ביכולת של MBD של אינטראקציה חלבון MBD2 האדם עם CpG מתיל כדי לחלץ דנ"א מועשר עם CpGs מתיל, וזה ואחריו רצף תפוקה גבוהה של DNA מתיל.

Protocol

האישור המוסרי לאיסוף דגימות ה- CLL הוא בין השנים 2007-05-21, עם מספר הרישום הבא: EPN Gbg dnr 239/07. כל חולי ה- CLL אובחנו בהתאם לקריטריונים המתוקנים לאחרונה 8 , והדגימות נאספו בזמן האבחון. החולים במחקר נכללו במחלקות המטולוגיות שונות במערב שוודיה לאחר קבלת הסכמה בכתב. רק ד?…

Representative Results

MBD-seq בוצע לאחרונה על חולי CLL ומתאים, נורמלי, בריא שולטת לזהות CLL ספציפי דיפרנציאלי היפר ו- hypomethylated גנים 7 . הצינור הניסויי והביואינפורמאטי המשמש לניתוח הנתונים הנוצרים מדגימות CLL ודגימות בריאות תקינות מוצג באיור 1 א ' וב -…

Discussion

MBD-seq הוא חסכוני, immunoprecipitation מבוסס טכניקה שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד דפוסי מתילציה עם כיסוי גנום רחב כולו. הן MeDIP seq (immunoprecipitation DNA methylated ואחריו רצף) ו- MBD-seq התוצאה העשרה של CpG עשיר DNA methylated. עם זאת, MBD-seq מראה זיקה יותר כלפי מחייב מאוד CpG עשירים אזורים בהשוואה ל MeDIP 19</…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מועצת המחקר השוודי, האגודה השבדית לסרטן, קרן קנוט ואליס ולנברג (KAW), ו FU VästraGötalandsregionen.

Materials

Dneasy Blood and tissue kit Qaigen 69504
Lymphoprep solution A X I S-S H I E L D 1114544
Nano drop 2000 Thermo Fischersceintific
TE buffer PH 8 Sigma aldrich 93283
Bioruptor standard sonication device Diagenode UCD-200
TPX bioruptor tubes 1.5ml Diagenode C30010010-300
3 M Sodium acetate Diagenode C03030002
E-gel iBase safe imager combo kit Thermo Fischersceintific G6465EU
E-gel 2% Agarose gels Thermo Fischersceintific G441002
Methylminer Methylated DNA enrichment kit Thermo Fischersceintific ME10025
Labquake Tube Shaker/Rotators Thermo Fischersceintific 415110
Dynal MPC-S Thermo Fischersceintific A13346
Vortex mixer VWR 12620-848
Absolute Ethanol Any company
70% Ethanool Any company
DNAse free water Milli Q
DNA precipitant (3M sodium acetate) Diagenode C03030002
Safe seal 1.5ml eppendorf tubes Eppendorf 4036-3204
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fischersceintific Q32851
Qubit 0.5ml tubes Thermo Fischersceintific Q32856
Qubit Thermo Fischersceintific Q32866
Illumina Hiseq2000 Platform Illumina
Water  Bath Grant
Heat block grant
Tube rotater Labquake

References

  1. Kanduri, M., et al. Differential genome-wide array-based methylation profiles in prognostic subsets of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 115 (2), 296-305 (2010).
  2. Cahill, N., et al. 450K-array analysis of chronic lymphocytic leukemia cells reveals global DNA methylation to be relatively stable over time and similar in resting and proliferative compartments. Leukemia. 27 (1), 150-158 (2013).
  3. Kanduri, M., et al. Distinct transcriptional control in major immunogenetic subsets of chronic lymphocytic leukemia exhibiting subset-biased global DNA methylation profiles. Epigenetics. 7 (12), 1435-1442 (2012).
  4. Kulis, M., et al. Epigenomic analysis detects widespread gene-body DNA hypomethylation in chronic lymphocytic leukemia. Nat Genet. 44 (11), 1236-1242 (2012).
  5. Booth, M. J., et al. Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution. Science. 336 (6083), 934-937 (2012).
  6. Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149 (6), 1368-1380 (2012).
  7. Subhash, S., Andersson, P. O., Kosalai, S. T., Kanduri, C., Kanduri, M. Global DNA methylation profiling reveals new insights into epigenetically deregulated protein coding and long noncoding RNAs in CLL. Clin Epigenetics. 8, 106 (2016).
  8. Hallek, M., et al. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 guidelines. Blood. 111 (12), 5446-5456 (2008).
  9. De Meyer, T., et al. Quality evaluation of methyl binding domain based kits for enrichment DNA-methylation sequencing. PLoS One. 8 (3), e59068 (2013).
  10. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  11. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
  12. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  13. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  14. Subhash, S., Kanduri, C. GeneSCF: a real-time based functional enrichment tool with support for multiple organisms. BMC Bioinformatics. 17 (1), 365 (2016).
  15. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
  16. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  17. Martinelli, S., et al. ANGPT2 promoter methylation is strongly associated with gene expression and prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Epigenetics. 8 (7), 720-729 (2013).
  18. Kopparapu, P. K., et al. Epigenetic silencing of miR-26A1 in chronic lymphocytic leukemia and mantle cell lymphoma: Impact on EZH2 expression. Epigenetics. 11 (5), 335-343 (2016).
  19. Robinson, M. D., et al. Evaluation of affinity-based genome-wide DNA methylation data: effects of CpG density, amplification bias, and copy number variation. Genome Res. 20 (12), 1719-1729 (2010).

Play Video

Cite This Article
Subhash, S., Kanduri, M. Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients. J. Vis. Exp. (124), e55773, doi:10.3791/55773 (2017).

View Video