Omvattende DNA-methyleringsanalyse met gebruikmaking van een methyle-CpG-bindende domein-opnamebaseerde methode bij patiënten met chronische lymfocytische leukemie

Het gebruik van volgende generatie sequencing technieken om globale DNA-methylering profielen te analyseren is in de afgelopen jaren steeds populairder geworden. Genoom-brede methyleringsbepalingen, met inbegrip van microarray- en niet-microarray gebaseerde methoden, werden ontwikkeld op basis van het volgende: de bisulfietomzetting van genomisch DNA, methylatiegevoelige restrictie-enzymverdigingen en de immunoprecipitatie van gemethyleerd DNA onder gebruikmaking van methyl-CpG-specifieke antilichamen .

Aberrant DNA methylering is een van de kenmerken van leukemie en lymfomen, waaronder chronische lymfocytische leukemie (CLL). Vroeger hebben verschillende groepen, waaronder onze, de DNA-methyleringsprofielen van verschillende CLL-prognostische subgroepen en normale, gezonde B-celcontroles gekenmerkt door gebruik te maken van de bisulfietomzetting van genomisch DNA, gevolgd door micro-array-gebaseerde methoden of sequentiebepaling van het genoom-genoom ^{1 , 2 , 3 ,} <Sup class = "xref"> 4. De bisulfietomzetting van genomisch DNA leidt tot de deaminatie van ongewijzigde cytosinen naar uracil, waardoor de gemodificeerde methylated cytosines in het genoom verlaten worden. Zodra geconverteerd kan de methyleringsstatus van het DNA bepaald worden door PCR amplificatie en sequentiebepaling onder toepassing van verschillende kwantitatieve of kwalitatieve methoden, zoals micro-array-gebaseerde of full-genome bisulfiet sequencing (WGBS). Hoewel bisulfietomzetting gebaseerde methoden veel voordelen hebben en veel gebruikt worden in verschillende kankersoorten om DNA-methyleringsniveaus te analyseren, zijn er een paar nadelen verbonden aan deze techniek. WGBS sequencing maakt het mogelijk om single-base pair resolutie met lagere hoeveelheden DNA en is de beste geschikte optie voor het analyseren van een groot aantal monsters. Echter, deze methode slaat er niet in om de wijzigingen tussen de 5 mC en 5 hmC niveaus in het genoom ^{5 , 6 te} differentiëren. Bovendien bieden microarray-gebaseerde methoden geen complete cOverage van het genoom.

In een recente studie uit ons laboratorium ⁷ werden immunoprecipitatie gebaseerde methoden, in plaats van bisulfietomzetting, gebruikt om zeer CpG-rijke, differentieel gemetileerde regio's op wereldwijde schaal te identificeren bij CLL-patiënten en normale gezonde controles. Inmethyl-CpG-bindende domein (MBD) sequentiebepaling van volgende generatie (MBD-seq), is de verrijking van dubbelstrengs gefragmenteerd DNA afhankelijk van de mate van CpG-methylering. Deze methode kan de nadelen van de bisulfietomzettingsmethode overwinnen en kan ook genoom-brede dekking van CpG-methylering op een onbevooroordeelde en PCR-onafhankelijke wijze verschaffen. Bovendien kan MBD-seq, in tegenstelling tot bisulfietomzettingsgebaseerde microarraymethoden, worden gebruikt om de methyleringsstatus van herhalende elementen te analyseren, zoals langdurige kernelementen (LINE's), korte interversionele kernelementen (SINE's), lange terminale herhalingen (LTRS), Enz . In vergelijking met bisulfietomzettingsmethoden,Een MBD-seq protocol vereist een relatief grote hoeveelheid input DNA. Ook leest de kwaliteit van de sequentie en de gegevens zijn afhankelijk van de specificiteit, affiniteit en kwaliteit van de gebruikte antilichamen.

De huidige studie legt een gedetailleerd MBD-seq protocol uit om methylated DNA te verrijken voor de volgende generatie sequencing. Het gebruikt een commerciële methylated DNA binding verrijkingskit (vermeld in de Material Table ), evenals een berekeningspijpleiding om de methylering sequencing data te visualiseren en te interpreteren om CLL-specifieke hyper- en hypomethylated gebieden te identificeren in vergelijking met normale gezonde controles. In principe maakt deze methode gebruik van het vermogen van de MBD van de menselijke MBD2-eiwitinteractie met gemethyleerde CpG's om DNA te verrijken verrijkt met gemethyleerde CpG's, en dit wordt gevolgd door de high-throughput sequencing van gemethyleerd DNA.