تحليل شامل للحمض النووي باستخدام طريقة ميثيل-كبغ الملزمة القائمة على الالتقاط في مرضى سرطان الدم الليمفاوي المزمن
Summary
يصف هذا العمل بروتوكول ميثيل-كبينغ ملزم (مبد) الأمثل، وخط أنابيب حسابية لتحديد مناطق ميثيلد الغنية بغاز كبغ في مرضى سرطان الدم الليمفاوي المزمن (كل).
Abstract
دور رناس طويلة غير المشفرة (لكرناس) في السرطان يأتي إلى الصدارة بسبب الاهتمام المتزايد في فهم وظائفهم الميكانيكية خلال تطور السرطان والتقدم. وعلى الرغم من ذلك، لم يتم التحقيق جيدا في التنظيم الجيني العالمي من لكرناس والتسلسلات المتكررة في السرطان، ولا سيما في سرطان الدم الليمفاوي المزمن (كل). وتركز هذه الدراسة على نهج فريد من نوعه: القبض على المناعي القائم على المزدوج تقطعت بهم السبل، شظايا الحمض النووي ميثليته باستخدام الميثيل ملزم المجال (مبد) البروتينات، تليها تسلسل الجيل القادم (مبد-سيق). تم في هذه الدراسة استخدام عينات المريض التي تنتمي إلى المجموعتين الفرعيتين النذيرتين (5 عينات متحولة من إيغف + 5 عينات غير مقيسة من إيغف). وقد كشف التحليل عن وجود 5،800 فرط مثلي و 12،570 من الجينات المميثلة المفرومة (كلدمغس) ذات ال هايبومثيلات مقارنة بالضوابط الصحية الطبيعية. الأهم من ذلك، حددت هذه النتائج عدة كل محددة، ليكرناس ميثليته مختلفة، إعادةالعناصر الجينية، وجينات ترميز البروتين مع قيمة النذير المحتملة. ويحدد هذا العمل بروتوكولا مفصلا لخط أنابيب مب-أدق ومعلوماتية أحيائية تم تطويره لتحليل شامل لمحات الميثيل العالمية في المناطق الغنية ب كبغ باستخدام عينات المريض كل. وأخيرا، تم التحقق من الجينات ترميز البروتين و لكرنا باستخدام بايروسكنسينغ، وهو طريقة كمية للغاية لتحليل مستويات مثيلة كبغ لمزيد من إثبات النتائج من بروتوكول مبد-سيق.
Introduction
وكان استخدام تقنيات الجيل القادم من التسلسل لتحليل الملامح العالمية مثيلة الحمض النووي شعبية متزايدة خلال السنوات الأخيرة. وقد تم تطوير مقايسات مثيلة على نطاق الجينوم، بما في ذلك أساليب ميكروأري وغير ميكروأري على أساس ما يلي: تحويل ثنائي الكبريتات من الحمض النووي الجيني، حساس انزيم انزيم حساس تقييد، ومناعي من الحمض النووي ميثليته باستخدام الميثيل كبغ محددة الأجسام المضادة .
مشتقات الحمض النووي الشاذة هي واحدة من السمات المميزة لسرطان الدم والأورام اللمفاوية، بما في ذلك سرطان الدم الليمفاوي المزمن (كل). في وقت سابق، العديد من المجموعات بما في ذلك لدينا وصف ملامح الحمض النووي مثيلة من المجموعات الفرعية كل برونوستيك مختلفة والضوابط طبيعية، صحية B- الخلية باستخدام تحويل ثنائي السلفيت من الحمض النووي الجيني، تليها مجموعة صغيرة المستندة إلى أساليب أو تسلسل الجينوم كامل 1 ، 2 ، 3 ، <سوب كلاس = "كريف"> 4. تحويل ثنائي السلفيت من الحمض النووي الجيني يؤدي إلى ديميناتيون من السيتوزينات غير المعدلة ل أوراسيل، وترك السيتوزينات ميثليته المعدلة في الجينوم. وبمجرد تحويلها، يمكن تحديد حالة مثيلة من الحمض النووي عن طريق التضخيم ير وتسلسل باستخدام أساليب كمية أو نوعية مختلفة، مثل مجموعة الصفيف الجزئي أو الجينوم كامل تسلسل الكبريت (وغبس). على الرغم من أن الأساليب القائمة على تحويل ثنائي الكبريت لديها العديد من المزايا وتستخدم على نطاق واسع في أنواع السرطان المختلفة لتحليل مستويات مثيلة الحمض النووي، وهناك عدد قليل من السلبيات المرتبطة بهذه التقنية. ويسمح تسلسل وغبس بدراسة قاعدة أحادية القاعدة مع كميات أقل من الحمض النووي وهو أفضل خيار مناسب لتحليل عدد كبير من العينات. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة تفشل في التفريق بين التعديلات بين 5 ماك و 5 مستويات همك في الجينوم 5 ، 6 . بالإضافة إلى ذلك، الأساليب القائمة على ميكروأري لا تقدم كاملة جالإفراط في الجينوم.
في دراسة حديثة من مختبرنا 7 ، تم استخدام أساليب إمنوبوريسيبيتاتيون القائمة، بدلا من تحويل ثنائي الكبريت، لتحديد عالية كبغ الغنية، ومختلف ميثليته المناطق على نطاق عالمي في المرضى كل والضوابط الصحية العادية. إنميثيل-كبغ ملزم المجال (مبد) الجيل القادم التسلسل (مبد-سيق)، وإثراء الحمض النووي مجزأة المزدوج تقطعت بهم السبل يعتمد على درجة مثيلة كبغ. هذا الأسلوب يمكن التغلب على عيوب طريقة تحويل ثنائي السلفيت ويمكن أيضا توفير تغطية على نطاق الجينوم من كبغ مثيلة بطريقة غير منحازة و ير مستقلة. بالإضافة إلى ذلك، خلافا لأساليب ميكروأري ميكروأري التحويل القائم على ثنائي السلفيت، يمكن استخدام مبد-سيق لتحليل حالة مثيلة من العناصر المتكررة، مثل العناصر النووية المتخلل طويلة (السطور)، قصيرة العناصر النووية المتخلل (سينيس)، يكرر محطة طويلة (لترس) الخ . ومع ذلك، بالمقارنة مع أساليب التحويل ثنائي الكبريت،يتطلب بروتوكول مب-سيق، كمية كبيرة نسبيا من الحمض النووي المدخلات. أيضا، نوعية التسلسل يقرأ والبيانات تعتمد على خصوصية، تقارب، ونوعية الأجسام المضادة المستخدمة.
وتشرح الدراسة الحالية بروتوكول مبد-سيق مفصل لإثراء الحمض النووي ميثليته لتسلسل الجيل القادم. وهي تستخدم مجموعة من مواد التخصيب الملزمة من الحمض النووي الميثيلية (المدرجة في جدول المواد )، فضلا عن خط أنابيب حاسوبي لتصور وتفسير بيانات تسلسل مثيلة لتحديد كل-هايبر-هيبيوميلاتد مناطق محددة مقارنة مع الضوابط الصحية العادية. في الأساس، وهذا الأسلوب يجعل من الاستفادة من قدرة مبد من الإنسان التفاعل البروتين MDD2 مع كبغ الميثيلين لاستخراج الحمض النووي المخصب مع كبغ الميثيل، ويتبع ذلك تسلسل عالية الإنتاجية من الحمض النووي ميثليته.
Protocol
Representative Results
Discussion
مبد-سيق هو تقنية فعالة من حيث التكلفة، على أساس مناعي التي يمكن استخدامها لدراسة أنماط مثيلة مع تغطية كاملة على نطاق الجينوم. كل من ميديب سيق (ميثليته الحمض النووي مناعي تليها التسلسل) والنتيجة مبد-سيق في إثراء الحمض النووي ميثيلاتد كبغ الغنية. ومع ذلك، مب-سيق يظهر ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة من قبل مجلس البحوث السويدي، والجمعية السويدية للسرطان، ومؤسسة كنوت وآليس والنبرغ (كاو)، وفو فاستراغوتالاندسريجيونين.
Materials
| Dneasy Blood and tissue kit | Qaigen | 69504 | |
| Lymphoprep solution | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
| Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE buffer PH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor standard sonication device | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX bioruptor tubes 1.5ml | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M Sodium acetate | Diagenode | C03030002 | |
| E-gel iBase safe imager combo kit | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-gel 2% Agarose gels | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| Methylminer Methylated DNA enrichment kit | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake Tube Shaker/Rotators | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| Vortex mixer | VWR | 12620-848 | |
| Absolute Ethanol | Any company | ||
| 70% Ethanool | Any company | ||
| DNAse free water | Milli Q | ||
| DNA precipitant (3M sodium acetate) | Diagenode | C03030002 | |
| Safe seal 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5ml tubes | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
| Water Bath | Grant | ||
| Heat block | grant | ||
| Tube rotater | Labquake |
References
- Kanduri, M., et al. Differential genome-wide array-based methylation profiles in prognostic subsets of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 115 (2), 296-305 (2010).
- Cahill, N., et al. 450K-array analysis of chronic lymphocytic leukemia cells reveals global DNA methylation to be relatively stable over time and similar in resting and proliferative compartments. Leukemia. 27 (1), 150-158 (2013).
- Kanduri, M., et al. Distinct transcriptional control in major immunogenetic subsets of chronic lymphocytic leukemia exhibiting subset-biased global DNA methylation profiles. Epigenetics. 7 (12), 1435-1442 (2012).
- Kulis, M., et al. Epigenomic analysis detects widespread gene-body DNA hypomethylation in chronic lymphocytic leukemia. Nat Genet. 44 (11), 1236-1242 (2012).
- Booth, M. J., et al. Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution. Science. 336 (6083), 934-937 (2012).
- Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149 (6), 1368-1380 (2012).
- Subhash, S., Andersson, P. O., Kosalai, S. T., Kanduri, C., Kanduri, M. Global DNA methylation profiling reveals new insights into epigenetically deregulated protein coding and long noncoding RNAs in CLL. Clin Epigenetics. 8, 106 (2016).
- Hallek, M., et al. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 guidelines. Blood. 111 (12), 5446-5456 (2008).
- De Meyer, T., et al. Quality evaluation of methyl binding domain based kits for enrichment DNA-methylation sequencing. PLoS One. 8 (3), e59068 (2013).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Subhash, S., Kanduri, C. GeneSCF: a real-time based functional enrichment tool with support for multiple organisms. BMC Bioinformatics. 17 (1), 365 (2016).
- Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Martinelli, S., et al. ANGPT2 promoter methylation is strongly associated with gene expression and prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Epigenetics. 8 (7), 720-729 (2013).
- Kopparapu, P. K., et al. Epigenetic silencing of miR-26A1 in chronic lymphocytic leukemia and mantle cell lymphoma: Impact on EZH2 expression. Epigenetics. 11 (5), 335-343 (2016).
- Robinson, M. D., et al. Evaluation of affinity-based genome-wide DNA methylation data: effects of CpG density, amplification bias, and copy number variation. Genome Res. 20 (12), 1719-1729 (2010).
