인간 승모판에서 단백질 추출을위한 최적화 된 프로토콜
Summary
인간 승모판의 단백질 조성은 여전히 부분적으로 알려지지 않았는데, 그 이유는 세포질이 낮아 단백질 생합성이 낮기 때문에 분석이 복잡하기 때문입니다. 이 연구는 승모판 프로테옴의 분석을 위해 단백질을 효율적으로 추출하기위한 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
세포 성 프로테옴의 분석은 복잡한 생물학적 시스템에 존재하는 단백질의 대규모 동정 및 정량화를 가능하게하는 기술의 개발로 인한 질병의 근원적 인 분자 기작을 밝히는데 도움이 될 수 있습니다. 단백질 학적 접근으로부터 얻은 지식은 잠재적으로 질병의 기초가되는 병원성 메커니즘에 대한 더 나은 이해, 새로운 진단 및 예후 질환 표지자의 확인 및 치료 목표의 희망을 가능하게한다. 그러나, 심장 승모판 막은 proteoglycan과 collagen-enriched extracellular matrix의 세포질이 낮기 때문에 proteomic analysis에서 매우 어려운 표본이됩니다. 이것은 전 지구적인 단백질 분석을 위해 단백질을 추출하는 것을 어렵게 만든다. 이 작품은 양적 proteomics 및 immunoblotting과 같은 후속 단백질 분석과 호환 프로토콜입니다. 이것은 데이터의 상관 관계를 허용 할 수있다.g 단백질 발현을 정량적 mRNA 발현 및 비 정량 면역 조직 화학적 분석에 대한 데이터로 비교 하였다. 사실, 이러한 접근법은 함께 수행 될 때 mRNA에서 번역 후 단백질 변형에 이르기까지 질병을 근본으로하는 분자 메커니즘에 대한보다 포괄적 인 이해로 이어질 것입니다. 따라서이 방법은 심장 판막 생리 병리학의 연구에 관심이있는 연구자들에게 적합 할 수있다.
Introduction
최근의 증거는 mRNA 합성 후 발생하는 많은 조절 기작의 역할에 대한 이해를 변화시켰다. 사실, 번역, post-transcriptional 및 proteolytic 프로세스는 단백질의 풍부와 기능을 조절할 수 있습니다. transcript level이 protein abundance의 주된 결정 인자라고 가정 할 때, mRNA 농도가 상응하는 단백질의 그것들에 대한 proxies라고 말하는 dogma는 부분적으로 수정되었다. transcript level은 단지 단백질의 양을 부분적으로 예측할 뿐이며, post-transcriptional events 세포 1 , 2 내의 단백질을 조절합니다.
또한, 단백질은 궁극적으로 세포의 기능을 지시하고 따라서 autocrine, paracrine 및 내분비 요인에 대한 응답으로 역동적 인 변화를 겪을 수있는 표현형을 지시합니다. 혈액 매개 매개체; 온도; 약물 치료; 질병이 생기다.ment. 따라서, 단백질 수준에 초점을 맞춘 표현 분석은 proteome을 특성화하고 질병 병인의 일부로 발생하는 중대한 변화를 밝혀내는 데 유용합니다 3 .
따라서 기존의 기술적 어려움에도 불구하고 건강과 질병 상태를 명확히하기 위해 프로테오믹스가 제시하는 기회는 엄청납니다. proteomics가 기여할 수있는 연구 분야 중 특히 유망한 분야 : 모든 수준 ( 즉, 전체 세포 또는 조직, 세포 내 구획 및 생물학적 유체)에서 단백질 발현의 변화 여부 확인; 질병의 진단 및 예후에 유용한 새로운 바이오 마커의 확인, 확인 및 확인; 약물 효과 및 독성 평가뿐만 아니라 치료 목적으로 사용될 수있는 새로운 단백질 표적의 확인 4 .
복잡성 포착프로테옴은 기술적 도전을 나타냅니다. 현재의 프로테오믹스 도구는 변경된 단백질 수준의 확인, 정량화 및 검증을 위해 대규모의 높은 처리량 분석을 수행 할 수있는 기회를 제공합니다. 또한, 가장 풍부한 단백질로 인한 간섭을 피하기위한 분획 화 및 농축 기술의 도입은 가장 풍부한 단백질을 포함시킴으로써 단백질 확인을 향상 시켰습니다. 마지막으로 proteomics는 단백질 기능의 중요한 조절 자로서 점차적으로 출현하는 번역 후 변형의 분석에 의해 보완되었다.
그러나 분석중인 생물 표본의 시료 준비 및 단백질 회수는 여전히 proteomic 워크 플로우의 제한 단계로 남아 있으며 가능한 함정 가능성을 높입니다. 사실, 최적화되어야하는 대부분의 분자 생물학 기술에서 첫 번째 단계는 조직 균질화이온 및 세포 용해, 특히 증폭 방법이 존재하지 않는 저농도 단백질의 분석에 유용합니다. 또한, 단백질의 화학적 특성은 자체 복구에 영향을 줄 수 있습니다. 예를 들어, 고도로 소수성 인 단백질의 분석은 isoelectric focusing 동안 쉽게 침전되기 때문에 매우 어렵습니다. 반면에 trans-membrane 단백질은 거의 용해되지 않습니다 (참고 문헌 5에서 검토). 또한, 조직 조성의 가변성은 보편적 인 추출 방법을 개발하는데 중요한 장벽이된다. 마지막으로, 거의 모든 임상 표본의 수량이 제한되어 있기 때문에 최소 샘플 양에서 최대 회수 및 재현성으로 단백질 준비를 할 수 있어야합니다.
이 작품은 proteomic 분석을위한 매우 도전 샘플을 나타내는 정상적인 인간의 심장 승모판에서 단백질 추출을위한 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 정상적인 승모판은좌심방과 심장 좌심실 사이에있는 렉스 구조 ( 그림 1 ). 심방에서 심실까지의 혈류를 조절하고 역류를 방지하며 전신에 적절한 수준의 산소 공급을 보장하여 적절한 심 박출량을 유지하는 데 중요한 역할을합니다. 그러나, 세포질이 적고 구성 요소가 거의없는 "비활성"조직으로 주로 간주됩니다 (주로 세포 외 기질에 있음). 이는 정상 상태에서 상주 판막 간질 세포 (VIC)가 낮은 단백질 생합성 률로 정지 상태를 나타 내기 때문입니다.
그러나 병리학 적 상태에서는 해면질 내의 VIC 수가 증가하고 단백질 합성이 다른 기능적 및 표현형 변화와 함께 활성화된다는 것이 입증되었습니다. 따라서, 최소한의 데이터를 사용할 수 있다는 것은 놀라운 일이 아닙니다.문헌은 병리학 승모판의 분석에 초점을 맞추고 있는데, 증가 된 수의 활성화 된 VIC가 확인 된 단백질의 상대적으로 많은 수를 설명 할 수있다.
결론적으로, 본 프로토콜은 승모판 막 단백질 성분의 연구를 통해 승모판 막 질환의 원인이되는 병원성 기전을 이해하는 데 도움이 될 수있다. 실제로, 근본적인 병리학 적 과정에 대한 더 깊은 이해는 혈류 역학적 인 고려 사항에 대한 현재의 적응증이있는 판막 질환의 임상 관리를 개선하는 데 도움이 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜의 한 가지 중요한 단계는 액체 질소를 사용하여 시료를 동결시키고 그라인더 시스템을 냉각시키는 것입니다. 액체 질소를 사용하면 생물학적 분해를 방지하고 분말 파우더를 효율적으로 사용할 수 있지만 안전한 취급을위한 특수 교육이 필요합니다.
이 프로토콜에는 작은 시료를 표준 박격포와 유봉에서 복구하기가 어렵 기 때문에 시료 분쇄를위한 분쇄기 시?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이탈리아 보건부는이 연구를 지원했습니다 (RC 2013-BIO 15). 그녀는 훌륭한 기술 지원을 해주신 Barbara Micheli에게 감사드립니다.
Materials
| Saline solution | 0.9 % NaCl | ||
| Eurocollins A | SALF | 30874046 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Eurocollins B | SALF | 30874022 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Wisconsin | Bridge life | RM/N 4081 | Balanced organ's transport medium |
| Biohazard vertical flow air | Burdinola | Class A GMP classification | |
| Dewar Flask | Thermo Scientific | Nalgene 4150-1000 | |
| Cryogrinder system | OPS diagnostics | CG 08-01 | Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver |
| Stainless steel forceps | |||
| Stainless steel spatula | |||
| Disposable sterile scalpel | Medisafe | MS-10 | |
| Stainless steel scissors | Autoclavable | ||
| Stainless steel picks | Autoclavable | ||
| Disposable sterile drap | Mon&Tex | 3.307.08 | |
| Sterilizing solution with isopropyl alcohol | 70% isopropyl alcohol | ||
| Sterilizing solution with hydrogen peroxide | 6% hydrogen peroxide | ||
| Micropipette, 1 mL, with tips | |||
| 15 mL centrifuge tubes | VWR international | 9278 | |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR international | PIER90410 | |
| Urea buffer | 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol | ||
| Urea | Sigma aldrich | U6504-1KG | To be used for Urea buffer |
| Thiourea | Sigma aldrich | T8656 | To be used for Urea buffer |
| CHAPS | Sigma aldrich | C3023-5GR | To be used for Urea buffer |
| Dithiotreitol | Sigma aldrich | D0632-5G | To be used for Urea buffer |
| Syringe 50 mL | PIC | To be used to filter Urea buffer | |
| 0.22 µm filter | Millipore | SLGP033RB | To be used to filter Urea buffer |
| PFTE Pestle, 2 mL | Kartell | 6302 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Borosilicate glass mortar | Kartell | 6102 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Stirrer | VELP scientifica | Stirrer DLH | To be used for homogenization by Potter-Elvehjem |
| Bradford Protein assay | Bio-Rad laboratories | 5000006 | |
| Tube rotator | Pbi International | F205 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Aluminum foil | |||
| Ice | |||
| Polystyrene box | |||
| Dry ice | |||
| Centrifuge | For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g | ||
| Freezer -80°C | |||
| Precision balance | |||
| Autoclave | For sterilization | ||
| Cryogenic gloves for liquid nitrogen | |||
| Gloves | |||
| Professional forced ventilation and natural air convection oven | For sterilization | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma aldrich | P8340-5ML | 100X solution |
| ProteoExtract Protein Precipitation Kit | Calbiochem | 539180 | |
| RapiGest | Waters | 186001861 | |
| Cytoscape | www.cytoscape.org | version 2.7 | Software platform for Gene Ontology analysis |
| BiNGO | http://apps.cytoscape.org/apps/bingo | version 3.0.3 | Plugin for Gene ontology analysis |
| AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody | Novus Biologicals | NBP1-97494 | Mouse monoclonal antibody against CryAB |
| Septin-11 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-83824 | Rabbit polyclonal antibody against septin-11 |
| FHL1 Antibody | Novus Biologicals | NBP-188745 | Rabbit polyclonal antibody against FHL-1 |
| Dermatopontin Antibody | Novus Biologicals | NB110-68135 | Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin |
| Goat Anti mouse IgG HRP | Sigma aldrich | A4416-0.5ML | Secondary antibody for immunoblotting |
| Goat Anti rabbit IgG HRP | Bio-Rad laboratories | 170-5046 | Secondary antibody for immunoblotting |
References
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