פרוטוקול אופטימיזציה עבור הפקת חלבונים מן שסתום מיטרלי האדם

עדויות האחרונות שינו את ההבנה של התפקידים של מנגנונים רגולטוריים רבים המתרחשים לאחר סינתזת mRNA. ואכן, תהליכים טרנסלציוניים, פוסט-תעתיקיים ופרוטוליטיים יכולים להסדיר את שפע החלבון ולתפקודו. הדוגמה – שאומרת כי ריכוזי ה- mRNA הם פרוקסי לאלה של החלבונים המתאימים, בהנחה שרמות התמלילים הן הגורם העיקרי לשפע החלבון – תוקנו חלקית. למרות זאת, רמות התמליל רק מנבאות באופן חלקי את כמות החלבון, מה שמרמז על אירועים פוסט-תעתיק להתרחש כדי לווסת את החלבונים בתוך תאים ^{1 , 2} .

יתר על כן, חלבונים בסופו של דבר להכתיב את הפונקציה של התא ולכן להכתיב פנוטיפ שלה, אשר יכול לעבור שינויים דינמיים בתגובה גורמים אוטוקרינית, פאראקרין, אנדוקרינית; מתווכים עם דם; טֶמפֶּרָטוּרָה; טיפול תרופתי; ואת המחלה לפתחמנט. לפיכך, ניתוח הביטוי התמקדו ברמת החלבון הוא שימושי כדי לאפיין את proteome ולפרם את השינויים הקריטיים המתרחשים אליו כחלק מחולי המחלה ³ .

לכן, את ההזדמנויות כי proteomics הנוכחי כדי להבהיר בריאות ומחלות התנאים הם אדירים, למרות האתגרים הטכנולוגיים הקיימים. התחומים המבטיחים במיוחד של מחקר, שבהם יכולים פרוטאומיסטים לתרום: זיהוי של ביטוי חלבון שונה בכל רמה ( כלומר, תאים שלמים או רקמות, תאים תת-תאיים ונוזלים ביולוגיים); זיהוי, אימות ואימות של סמנים ביולוגיים חדשים המשמשים לאבחון ולפרוגנוזה של מחלות; וכן, בתקווה, זיהוי של מטרות חלבון חדש שניתן להשתמש בהם למטרות טיפוליות, כמו גם להערכת יעילות התרופות ואת הרעילות ⁴ .

לכידת המורכבות שלהפרוטאום מייצג אתגר טכנולוגי. כלים proteomic הנוכחי מציעים את ההזדמנות לבצע בקנה מידה גדול, תפוקה גבוהה ניתוח עבור זיהוי, כימות, ואימות של רמות חלבון השתנה. בנוסף, הכנסת שיטות חלוקה והעשרה, שמטרתן למנוע את ההפרעה הנגרמת על ידי החלבונים השופעים ביותר, שיפרה גם את זיהוי החלבון על ידי הכללת החלבונים הפחות שופעים. לבסוף, proteomics הושלמה על ידי ניתוח של שינויים לאחר translational, אשר בהדרגה מופיעים כמו מאפננים חשובים של תפקוד החלבון.

עם זאת, ההכנה המדגם התאוששות חלבון בדגימות ביולוגי תחת ניתוח עדיין להישאר הגבלת הצעדים של זרימת העבודה proteomic ולהגדיל את הפוטנציאל האפשרי pitfalls ⁵ . ואכן, ברוב טכניקות ביולוגיה מולקולרית כי חייב להיות מותאם, הצעדים הראשונים הם homogenizat רקמותיון ותאי תא, במיוחד במהלך ניתוח של חלבונים בשפע נמוכה עבורם שיטות הגברה לא קיימים. בנוסף, הטבע הכימי של חלבונים יכול להשפיע על ההתאוששות שלהם. לדוגמה, ניתוח של חלבונים הידרופובי מאוד הוא מאתגר מאוד, כי הם מזרזים בקלות במהלך ההתמקדות isoelectric, בעוד חלבונים ממברנה טרנס הם כמעט בלתי מסיסים (נסקרת ב הפניה 5). יתר על כן, השתנות הרכב הרקמה יוצרת מחסום משמעותי לפיתוח שיטת החילוץ האוניברסלית. לבסוף, כי כמעט כל הדגימות הקליניות הן של כמות מוגבלת, זה חיוני כדי לאפשר הכנת חלבון עם התאוששות מקסימלית reproducibility מ כמויות מדגם מינימלי ⁶ .

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול אופטימיזציה עבור החילוץ חלבון מן השסתום המיטרלי של הלב האנושי, המייצג מדגם מאתגר מאוד עבור ניתוח proteomic. שסתום מיטרלי רגיל הוא compמבנה lx שוכב בין אטריום שמאל החדר השמאלי של הלב ( איור 1 ). זה משחק תפקיד חשוב בשליטה על זרימת הדם מן אטריום החדר, מניעת backflow ולהבטיח את רמת נאותה של אספקת חמצן לכל הגוף, ובכך לשמור על פלט לב נאותה. עם זאת, הוא נחשב לעתים קרובות רקמה "לא פעילה", עם תאיות נמוכה כמה רכיבים, בעיקר מטריקס תאיים. הסיבה לכך היא, בתנאים נורמליים, התאים intervitial valvular תושב (VICs) להציג פנוטיפ שקט עם שיעור נמוך biosynthesis חלבון ⁷ .

עם זאת, הוכח כי במצב פתולוגי, מספר VICs ב spongiosa עולה סינתזת החלבון שלהם מופעל, יחד עם שינויים פונקציונליים אחרים פנוטיפי ⁸ . לכן, אין זה מפתיע כי הנתונים המינימליים הזמיניםהספרות מתמקדת בניתוח של שסתומים מיטרליים פתולוגיים ^{9 , 10} , שבהם מספר מוגבר של VICs מופעל עשוי להסביר את המספר הגבוה יחסית של חלבונים מזוהים.

לסיכום, פרוטוקול זה עשוי לשמש כדי להבין את ההבנה של מנגנונים פתוגניים האחראים על מחלות שסתום מיטרלי באמצעות מחקר של מרכיבי חלבון מיטרלי שסתום. ואכן, הבנה גדולה יותר של התהליכים הפתולוגיים הבסיסיים יכולה לסייע בשיפור הניהול הקליני של מחלות שסתום, אשר האינדיקציות הנוכחיות שלהם להתערבות מבוססות במידה רבה על שיקולים המודינאמיים.