Protocole optimisé pour l'extraction de protéines à partir de la soupape mitrale humaine

Des preuves récentes ont modifié la compréhension des rôles des nombreux mécanismes de régulation qui se produisent après la synthèse de l'ARNm. En effet, les processus translationnels, post-transcriptionnels et protéolytiques peuvent réguler l'abondance et la fonction des protéines. Le dogme – qui indique que les concentrations d'ARNm sont des proxies de celles des protéines correspondantes, en supposant que les niveaux de transcription sont le principal déterminant de l'abondance des protéines – ont été partiellement révisés. En effet, les niveaux de transcription ne prédisent partiellement que l'abondance des protéines, ce qui suggère que les événements post-transcriptionnels Se produisent pour réguler les protéines dans les cellules ^{1 , 2} .

En outre, les protéines déterminent finalement la fonction de la cellule et dictent donc son phénotype, qui peut subir des changements dynamiques en réponse aux facteurs autocrins, paracrins et endocriniens; Médiateurs transmis par le sang; température; traitement médical; Et la maladie se développeMent. Ainsi, une analyse d'expression axée sur le niveau de protéine est utile pour caractériser le protéome et pour démêler les changements critiques qui lui apparaissent dans le cadre de la pathogenèse de la maladie ³ .

Par conséquent, les opportunités que la protéomique présente pour clarifier la santé et les maladies sont formidables, malgré les défis technologiques existants. Les domaines de recherche particulièrement prometteurs auxquels la protéomique peut contribuer: l'identification de l'expression protéique altérée à n'importe quel niveau ( c.-à-d. Cellules entières ou tissus, compartiments subcellulaires et fluides biologiques); L'identification, la vérification et la validation de nouveaux biomarqueurs utiles pour le diagnostic et le pronostic de la maladie; Et, espérons-le, l'identification de nouvelles cibles protéiques qui peuvent être utilisées à des fins thérapeutiques, ainsi que pour l'évaluation de l'efficacité et de la toxicité du médicament ⁴ .

Capture de la complexité deLe protéome représente un défi technologique. Les outils protéomiques actuels offrent l'opportunité d'effectuer une analyse à grande échelle et à haut débit pour l'identification, la quantification et la validation des niveaux de protéines altérés. En outre, l'introduction de techniques de fractionnement et d'enrichissement, visant à éviter les interférences causées par les protéines les plus abondantes, a également amélioré l'identification des protéines en incluant les protéines les moins abondantes. Enfin, la protéomique a été complétée par l'analyse des modifications post-traductionnelles, qui apparaissent progressivement comme des modulateurs importants de la fonction protéique.

Cependant, la préparation des échantillons et la récupération des protéines dans les échantillons biologiques en cours d'analyse restent les étapes limitantes du flux de travail protéomique et augmentent le potentiel d'écueils possibles ⁵ . En effet, dans la plupart des techniques de biologie moléculaire qui doivent être optimisées, les premières étapes sont des tissus homogénéisésLa lyse ionique et cellulaire, en particulier lors de l'analyse de protéines à faible abondance pour lesquelles des méthodes d'amplification n'existent pas. En outre, la nature chimique des protéines peut influencer leur propre récupération. Par exemple, l'analyse des protéines hautement hydrophobes est très difficile car elles se précipitent facilement pendant la focalisation isoélectrique, tandis que les protéines trans-membranaires sont presque insolubles (revues dans la référence 5). En outre, la variabilité de la composition tissulaire crée un obstacle important au développement d'une méthode d'extraction universelle. Enfin, étant donné que la quasi-totalité des spécimens cliniques ont une quantité limitée, il est essentiel de permettre la préparation des protéines avec une récupération maximale et une reproductibilité à partir de quantités minimales d'échantillon ⁶ .

Ce travail décrit un protocole optimisé pour l'extraction de protéines à partir de la valvule mitrale cardiaque humaine normale, ce qui représente un échantillon très difficile pour l'analyse protéomique. La valvule mitrale normale est une compStructure lex située entre l'oreillette gauche et le ventricule gauche du cœur ( figure 1 ). Il joue un rôle important dans le contrôle du flux sanguin de l'oreillette au ventricule, en évitant le reflux et en assurant le bon niveau d'apport en oxygène à l'ensemble du corps, en maintenant un débit cardiaque adéquat. Cependant, il est souvent considéré comme un tissu «inactif», avec une faible cellularité et peu de composants, principalement dans la matrice extracellulaire. C'est parce que, dans des conditions normales, les cellules interstitielles valvulaires résidentes (VIC) présentent un phénotype quiescent avec un taux de biosynthèse faible en protéines ⁷ .

Cependant, il a été démontré que, dans un état pathologique, le nombre de VIC dans le spongiosa augmente et que leur synthèse protéique est activée, ainsi que d'autres changements fonctionnels et phénotypiques ⁸ . Par conséquent, il n'est pas surprenant que les données minimales disponibles dansLa littérature se concentre sur l'analyse des valves mitrales pathologiques ^{9 , 10} , dans lesquelles le nombre accru de VIC activés pourrait expliquer le nombre relativement élevé de protéines identifiées.

En conclusion, le présent protocole peut servir à développer la compréhension des mécanismes pathogènes responsables des maladies de la valvule mitrale par l'étude des composants des protéines valvulaires mitrales. En effet, une meilleure compréhension des processus pathologiques sous-jacents pourrait aider à améliorer la gestion clinique des maladies des valvules, dont les indications actuelles d'intervention sont principalement fondées sur des considérations hémodynamiques.