低温での水性ガラスの密度の測定

それらの様々な段階における水および水性混合物の物理的特性は、基本的な関心事であり、生物学的系のインビボおよびインビトロでの理解にとって重要である。現代の低温生物学および生物学的凍結保存では、凍結保護剤水溶液のガラス質または非晶質相が特に興味深い^1,2 。氷結晶の核形成および増殖は、細胞および組織を破壊し、タンパク質の変性および凝集を促進し、溶媒をガラス化する凍結保存プロトコールがますます普及している。生体分子結晶学において、生体分子間のチャネルにおける溶媒の結晶化は結晶格子を破壊し、回折特性を劣化させる。ガラス化は、急速冷却、脱水、およびグリセロール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール（PEG）などの凍結保護溶質の添加の組み合わせによって達成される。アルコールおよび塩が挙げられる。

ガラス化は氷の結晶化および成長を制限するが、冷却関連の試料の損傷をすべて排除するものではない。例えば、タンパク質結晶がガラス化状態^3に冷却され、ガラス化された精子細胞および卵母細胞の解凍後の生存率が広範に変化する場合、結晶のモザイシシティ（結晶面の配向の尺度）は、通常、10〜 。

1つの損傷メカニズムは^、冷却中の溶媒および周囲の物質の差別的な収縮である^3,4,5 。結晶、細胞または組織内の平衡溶媒および溶質濃度は温度依存性であり、溶媒+溶質および周囲物質は異なる量で収縮し得る。迅速な冷却は、ガラス化前の溶媒および溶質の再分配を防止することができ、不均一な非平衡応力が試料の損傷の原因となることがあります。

冷却によって誘発される損傷を減少させる合理的なアプローチは、液体およびガラス化した水性混合物の温度依存密度の知識から利益を得ることができる。溶液の重量に対する溶質の重量（w / w）の50％以上の溶質濃度では、ほとんどの水性凍結保護剤混合物を10 K / s以下の適度な冷却速度でガラス化することができ、大きなガラス質試料を用いて密度測定を行い、密度は、窒素のような液体寒剤に懸濁したときの試料の見かけの重量を測定することによって、アルキメデスの原理を用いて決定することができる。しかし、溶質の濃度が低下すると、ガラス化に必要な冷却速度が急速に上昇します。水性グリセリン混合物の冷却速度は、gの溶質の50％重量で10 K / sからmL（w / v） K /秒で25％w / vass = "xref"> 7。熱伝達は境界層に制限されるので、より大きな冷却速度を達成するためには、より小さい試料⁸が必要となる。

純粋な硝子水と氷の密度の測定は、巨視的な（グラム質量）試料を構築するために極低温冷却表面上に真空中のマイクロメーター直径（フェムトリットル体積）滴を堆積させることによって達成されている。この試料の密度は液体窒素 – アルゴン混合物中でのクライオフロット法により測定した。この場合、試料が中性に浮揚するまで低温液体の密度を調整した。しかし、従来のガラス質相の密度測定における誤差の重要な原因である空隙量を最小限に抑える方法で、多数の小さな液滴から大きなサンプルを生成することは、自明ではありません。水性混合物の場合、エアロゾル化および真空中での堆積中の溶液成分の差別的な蒸発は、堆積した濃度における実質的な不確実性。

私たちは、クライオフロット法に基づいた方法を開発しました。この方法では、個々の液滴を50μLほどの小さなものを使って水性混合物を正確に密度測定することができます。これらの滴は、元の濃度を維持しながら急速に冷却することができ、X線回折測定と相関する単純な視覚アッセイを使用して極低温状態（ガラス化または結晶化）を評価することができます。この方法は、水性および非水性混合物に広く適用可能であり、細胞（ 例えば 、茎および卵）、組織サンプル、および0.8〜1.4g / mlの低温密度を有するタンパク質結晶を含む様々な生物学的サンプルに拡張することができる。 mLであった。