Анализ суперкомплексов транспортной цепи митохондриальных электронов с собственным электрофорезом, в-гель-анализах и электроизлучения

Митохондриальная энергия в виде АТФ не только необходима для выживания клеток, но и для регуляции клеточной смерти. Генерация АТФ путем окислительного фосфорилирования требует функциональной транспортной цепи электрона (ETC, Cx-I-IV) и митохондриальной АТФ-синтазы (Cx-V). Недавние исследования показали, что эти крупные белковые комплексы организованы в суперкомплексы, называемые респирасомами и синтасомами ^{1 , 2} . Трудно проанализировать сборку, динамику и регулирование активности этих массивных комплексов и суперкомплексов. В то время как измерения потребления кислорода, проведенные с помощью кислородного электрода и анализа ферментов, проводимые с использованием спектрофотометра, могут дать ценную информацию о активности комплекса ETC, эти анализы не могут предоставить информацию о составе присутствия, размера и субъединицы белкового комплекса или суперкомплексов. Тем не менее, развитие синего и чистого родного (BN и CN соответственно). СТРАНИЦА ³ создала мощный инструмент для выявления важной информации о сложном составе и сборе / разборке и о динамической регуляции супрамолекулярной организации этих жизненно важных респираторных комплексов в физиологических и патологических условиях.

Сборка этих комплексов в суперкомплексах высшего порядка, по-видимому, регулирует структуру и функцию митохондрий ⁵ . Например, респираторная сборка повышает эффективность переноса электрона и генерирование движущей силы протона через внутреннюю мембрану митохондрии ⁵ . Кроме того, сборка синтазомов не только повышает эффективность производства АТФ и перенос энергетических эквивалентов в цитоплазму ² , но также формирует митохондриальную внутреннюю мембрану в трубчатые кристы ^{6 , <}/ Sup> ⁷ . Исследования суперкомплексной сборки во время развития сердца у эмбрионов мыши показывают, что генерация суперкомплексов Cx-I в сердце начинается примерно с эмбрионального дня 13,5 ⁸ . Другие показали, что количество суперкомплексов, содержащих Cx-I, уменьшается в сердце из-за старения или повреждений от ишемии / реперфузии ^{9 , 10} или может играть роль в прогрессировании нейродегенеративных заболеваний ¹¹ .

В этом протоколе описаны методы для основного гелевого PAGE, которые могут быть использованы для исследования сборки и активности комплексов ETC и суперкомплексов. Примерную молекулярную массу митохондриальных суперкомплексов можно оценить путем разделения белковых комплексов на полиакриламидные гели CN или BN. CN PAGE также позволяет визуализировать ферментативную активность всех митохондриальных комплексов непосредственно в геле (in-gel assays;ИГА) ¹² . Эта работа демонстрирует активность респирасом, выделяя способность Cx-I окислять NADH через IGA и присутствие синтазомов из-за активности АТФ-гидролиза Cx-V с помощью IGA. Множественные комплексы и суперкомплексы, содержащие Cx-I и Cx-V, можно также продемонстрировать путем переноса белков на нитроцеллюлозные мембраны и проведения иммуноблоттинга. Преимущество этого подхода состоит в том, что BN или CN PAGE обычно разделяют белковые комплексы на основе их физиологических размеров и состава; Перенос на мембрану сохраняет эту картину полос. Анализ белковых комплексов в BN или CN PAGE также может быть осуществлен с использованием 2D-PAGE (см. Fiala и др. ¹³ для демонстрации) или центрифугированием плотности сахарозы ^{14 , 15} . Для дальнейшего анализа конкретной полосы ее можно вырезать из BN PAGE, и белки из этого белкового комплекса могут быть очищеныD путем электроэлюции их в естественных условиях. Наземная электроэлюция может быть выполнена в течение нескольких часов, что может существенно повлиять на пассивную диффузию (как используется в ссылке 16) белков из геля в окружающий буфер.

Таким образом, эти методы описывают несколько подходов, которые позволяют дополнительно характеризовать высокомолекулярные суперкомплексы из митохондриальных мембран.