Analyse des supercomplexes de la chaîne de transport d'électrons mitochondriaux avec électrophorèse native, essais en gel et électroélution
Summary
Ce protocole décrit la séparation des complexes fonctionnels de la chaîne de transport d'électrons mitochondriaux (Cx) IV et des supercomplexes de ceux-ci en utilisant une électrophorèse native pour révéler des informations sur leur assemblage et leur structure. Le gel natif peut être soumis à un immunoblot, des essais en gel et une purification par électroélution pour caractériser davantage les complexes individuels.
Abstract
La chaîne de transport d'électrons mitochondriaux (ETC) transduit l'énergie dérivée de la décomposition de divers combustibles dans la monnaie bioénergétique de la cellule, l'ATP. L'ETC est composé de 5 complexes de protéines massives, qui s'ajoutent également aux supercomplexes appelés respirasomes (CI, C-III et C-IV) et synthasomes (CV) qui augmentent l'efficacité du transport d'électrons et de la production d'ATP. Diverses méthodes ont été utilisées depuis plus de 50 ans pour mesurer la fonction ETC, mais ces protocoles ne fournissent pas d'informations sur l'assemblage de complexes individuels et de supercomplexes. Ce protocole décrit la technique de l'électrophorèse sur gel de gel de polyacrylamide (PAGE), méthode qui a été modifiée il y a plus de 20 ans pour étudier la structure du complexe ETC. L'électrophorèse native permet la séparation des complexes ETC dans leurs formes actives, et ces complexes peuvent ensuite être étudiés à l'aide d'immunoblot, d'essais en gel (IGA) et de purification par électroélution. En combinant le reLes résultats de la PAGE de gel native avec ceux d'autres essais mitochondriaux, il est possible d'obtenir une image complète de l'activité ETC, son assemblage et démontage dynamique, et comment cela régule la structure et la fonction mitochondriales. Ce travail traitera également des limites de ces techniques. En résumé, la technique de la PAGE native, suivie de l'immunoblot, de l'IGA et de l'électroélution, présentée ci-dessous, est un moyen puissant d'étudier la fonctionnalité et la composition des supercomplexes ETC mitochondriales.
Introduction
L'énergie mitochondriale sous forme d'ATP n'est pas seulement essentielle pour la survie cellulaire, mais aussi pour la régulation de la mort cellulaire. La génération d'ATP par phosphorylation oxydante nécessite une chaîne fonctionnelle de transport d'électrons (ETC, Cx-I à IV) et une ATP synthase mitochondriale (Cx-V). Des études récentes ont montré que ces grands complexes de protéines sont organisés en supercomplexes, appelés respirasomes et synthasomes 1 , 2 . Il est difficile d'analyser l'assemblage, la dynamique et la régulation de l'activité de ces complexes et supercomplexes massifs. Alors que les mesures de consommation d'oxygène prises avec une électrode d'oxygène et des dosages enzymatiques menés à l'aide d'un spectrophotomètre peuvent donner des informations précieuses sur l'activité du complexe ETC, ces analyses ne peuvent pas fournir d'informations concernant la présence, la taille et la composition de sous-unité du complexe de protéines ou des supercomplexes impliqués. Cependant, le développement de natif bleu et clair (BN et CN, respectivement) PAGE 3 a créé un outil puissant pour révéler des informations importantes sur la composition complexe et le montage / démontage et sur la régulation dynamique de l'organisation supramoléculaire de ces complexes respiratoires vitaux dans des conditions physiologiques et pathologiques 4 .
L'assemblage de ces complexes en supercomplexes d'ordre supérieur semble réguler la structure et la fonction 5 mitochondriales. Par exemple, l'assemblage respirasome augmente l'efficacité du transfert d'électrons et la génération de la force motrice du proton à travers la membrane interne mitochondriale 5 . En outre, l'assemblage des synthasomes augmente non seulement l'efficacité de la production d'ATP et le transfert d'équivalents d'énergie dans le cytoplasme 2 , mais il forme également la membrane interne mitochondriale dans les crêtes tubulaires 6 , </ Sup> 7 . Les études d'assemblage de supercomplexes lors d'un développement cardiaque dans des embryons de souris montrent que la génération de supercomplexes contenant du Cx-I dans le cœur commence à environ le jour embryonnaire 13,5 8 . D'autres ont montré que la quantité de supercomplexes contenant du Cx-I diminue dans le cœur en raison du vieillissement ou des blessures par ischémie / reperfusion 9 , 10 ou peut jouer un rôle dans la progression des maladies neurodégénératives 11 .
Ce protocole décrit des méthodes pour le gel natif PAGE qui peuvent être utilisées pour étudier l'assemblage et l'activité des complexes ETC et des supercomplexes. Le poids moléculaire approximatif des supercomplexes mitochondriaux peut être évalué en séparant les complexes de protéines dans des gels de polyacrylamide CN ou BN. La PAGE CN permet également la visualisation de l'activité enzymatique de tous les complexes mitochondriaux directement dans le gel (dosage en gel;IGA) 12 . Ce travail démontre l'activité des respirasomes en soulignant la capacité du Cx-I à oxyder le NADH par IGA et la présence de synthasomes en raison de l'activité d'hydrolyse ATP de Cx-V par IGA. Les complexes multiples et les supercomplexes contenant Cx-I et Cx-V peuvent également être démontrés en transférant les protéines sur des membranes de nitrocellulose et en effectuant un immunoblot. L'avantage de cette approche est que BN ou CN PAGE sépare généralement les complexes de protéines en fonction de leur taille et de leur composition physiologiques; Le transfert vers une membrane préserve ce motif de bandes. L'analyse de complexes de protéines dans une PAGE BN ou CN peut également être effectuée en utilisant 2D-PAGE (voir Fiala et al 13 pour une démonstration) ou par centrifugation 14 , 15 de densité de saccharose. Pour analyser plus avant une bande spécifique, elle peut être excisée de la BN PAGE, et les protéines de ce complexe protéinique peuvent être purifiéesD en les électroelutant dans des conditions natives. L'électroélution native peut être effectuée en quelques heures, ce qui pourrait faire une différence significative pour la diffusion passive (telle qu'utilisée dans la référence 16) des protéines d'un gel dans le tampon environnant.
En résumé, ces méthodes décrivent plusieurs approches qui permettent de caractériser davantage les supercomplexes de poids moléculaire élevé des membranes mitochondriales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un ETC fonctionnel est nécessaire pour la génération d'ATP mitochondriale. Les complexes de l'ETC peuvent former deux types de supercomplexes: les respirasomes (Cx-I, -III et -IV) 1 et les synthasomes (Cx-V) 2 . L'assemblage de chaque complexe est nécessaire pour un ETC intact, alors que l'organisation de l'ETC en supercomplexes est censée augmenter l'efficacité générale ETC 5 , 22 ….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de l'American Heart Association Founder's Affiliate [12GRNT12060233] et le Strong Children's Research Centre de l'Université de Rochester.
Materials
| Protean II mini-gel chamber | Biorad | 1658004 | Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis |
| Protean XL maxi-gel | Biorad | 1653189 | Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis |
| Gradient maker, Hoefer SG15 | VWR | 95044-704 | Pouring mini-gel gradients |
| Gradient maker, maxi-gel | VWR | GM-100 | Pouring maxi-gel gradients |
| Transfer kit | Biorad | 1703930 | Complete set to wet transfer of proteins onto membranes |
| Electroeluter model 422 | Biorad | 1652976 | Electroelution of proteins from native or SDS PAGES |
| Glass plates | Biorad | 1653308 | Short plates |
| Glass plates | Biorad | 1653312 | Spacer plates |
| Glass plates | Biorad | 1651823 | Inner plates |
| Glass plates | Biorad | 1651824 | Outer Plates |
| Power supply | Biorad | 1645070 | Power supply suitable for native electrophoresis |
| ECL-Western | Thermo Scientific | 32209 | Chemolumniscense substrate |
| SuperSignal-West Dura | Thermo Scientific | 34075 | Enhanced chemolumniscense substrate |
| Film/autoradiography film | GE Health care | 28906845 | Documentation of Western blots |
| Film processor CP1000 | Agfa | NC0872640 | |
| Canon Power Shot 640 | Canon | NA | Taking photos to document gels, membranes and blots. |
| Canon Power Shot 640 Camera hood | Canon | shielding camera for photos being taken on a light table | |
| Acrylamide/bisacrylamide | Biorad | 1610148 | 40% pre-mixed solution |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | Invitrogen | 15525-017 | |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Buffer |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Sodium deoxychelate | Sigma | D66750 | Detergent |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | Buffer |
| Imidazole | Sigma | I15513 | Buffer |
| Lauryl maltoside | Sigma | D4641 | Detergent |
| Coomassie G250 | Biorad | 161-0406 | |
| Aminohexanoic acid | Sigma | O7260 | |
| Native molecular weight kit | GE Health care | 17-0445-01 | High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NADH | Sigma | N4505 | |
| Nitroblue tetrazolium | Sigma | N6639 | |
| Tris HCL | Sigma | T3253 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2): | Sigma | 228621 | |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| anti-ATP5A | Abcam | ab14748 | antibody to ATP synthase subunit ATP5A |
| anti-NDUFB6 | Abcam | ab110244 | antibody to Cx-1 subunit NDUFB6 |
| anti-VDAC | Calbiochem | 529534 | antibody to VDAC |
| ECL HRP linked antibody | GE Health Care | NA931V | secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC |
| Blocking reagent | Biorad | 170-6404 | |
| BSA | |||
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silver staining Kit | Invitrogen | LC6070 |
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