Maus-neuronale Zellen, die auf Multi-Elektroden-Arrays kultiviert werden, zeigen eine Erhöhung der Reaktion nach elektrischer Stimulation. Dieses Protokoll demonstriert, wie man Neuronen kultiviert, wie man Aktivität aufnimmt und wie man ein Protokoll aufbaut, um die Netze zu trainieren, um auf Stimulationsmuster zu reagieren.
Mikroelektroden-Arrays (MEAs) können verwendet werden, um die Toxizität von Medikamenten zu untersuchen, Designparadigmen für die personalisierte Medizin der nächsten Generation zu entwickeln und die Netzwerkdynamik in neuronalen Kulturen zu untersuchen. Im Gegensatz zu herkömmlicheren Methoden wie Patch-Clamping, die nur die Aktivität von einer einzigen Zelle aufzeichnen können, können MEAs gleichzeitig von mehreren Standorten in einem Netzwerk aufzeichnen, ohne dass die schwierige Aufgabe besteht, jede Elektrode einzeln zu platzieren. Darüber hinaus können zahlreiche Kontroll- und Stimulationskonfigurationen problemlos innerhalb des gleichen Versuchsaufbaus angewendet werden, so dass ein breites Spektrum an Dynamik erforscht werden kann. Eine der Hauptdynamik von Interesse an diesen In-vitro- Studien war das Ausmaß, in dem kultivierte Netzwerke Eigenschaften zeigen, die das Lernen angeben. Maus-neuronale Zellen, die auf MEAs kultiviert werden, zeigen eine Erhöhung der Reaktion nach dem Training durch elektrische Stimulation induziert. Dieses Protokoll zeigt, wie man neuronale Zellen auf MEAs kultiviert; Erfolgreich reSchnur von über 95% der plattierten Schüsseln; Ein Protokoll erstellen, um die Netzwerke zu trainieren, um auf Stimulationsmuster zu reagieren; Und sortieren, plotten und interpretieren die Ergebnisse aus solchen Experimenten. Die Verwendung eines proprietären Systems zur Stimulierung und Aufzeichnung von neuronalen Kulturen wird gezeigt. Softwarepakete werden auch verwendet, um neuronale Einheiten zu sortieren. Eine benutzerdefinierte grafische Benutzeroberfläche wird verwendet, um Post-Stimulus-Zeit-Histogramme, Inter-Burst-Intervalle und Burst-Dauer zu visualisieren sowie die zelluläre Antwort auf Stimulation vor und nach einem Trainingsprotokoll zu vergleichen. Schließlich werden repräsentative Ergebnisse und zukünftige Richtungen dieser Forschungsarbeit diskutiert.
Mikroelektroden-Arrays (MEAs) können zur Untersuchung von Arzneimitteltoxizität, Designparadigmen für die personalisierte Medizin der nächsten Generation und zur Untersuchung der Netzwerkdynamik in neuronalen Kulturen verwendet werden 1 . Im Gegensatz zu herkömmlicheren Methoden, wie z. B. Patch-Clamping, die nur die Aktivität aus einer einzigen Zelle oder Feldaufzeichnung mit einer Glaspipette aufzeichnen können, die extrazelluläre Reaktionen von den Neuronen aufnehmen kann, die die Elektrode an einer einzigen Stelle umgeben, können MEAs gleichzeitig gleichzeitig sein Aufzeichnung von mehreren Standorten in einer Zellkultur, ohne die schwierige Aufgabe, jede Elektrode einzeln zu platzieren. Dies ermöglicht das Studium der dynamischen Wechselwirkungen zwischen Zellengruppen, die ein Netzwerk innerhalb dieser Kultur bilden. Darüber hinaus sind die Auswirkungen der elektrischen Stimulation auf die Netzwerkfeuerungsmuster 2 , 3 , 4 , 5 und die Netzwerksteuerung 6 </ Sup> in neuronalen Kulturen wurden gut dokumentiert, und zahlreiche Konfigurationen von elektrischer Stimulation und Kontrollen können problemlos innerhalb des gleichen Versuchsaufbaus angewendet werden, so dass eine breite Palette von räumlich-zeitlichen Dynamiken erforscht werden kann.
Eine der wichtigsten Dynamik von Interesse an diesen In-vitro- Studien war das Ausmaß, in dem kultivierte Netzwerke Eigenschaften zeigen, die das Lernen zeigen 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Das Peixoto-Labor untersuchte bisher die Effekte von hochfrequenten Trainingssignalen, wie in Ruaro et al. 14 , auf Netzwerken von Maus-Neuronen, die auf Mikroelektroden-Arrays plattiert sind. In diesen Experimenten zeigten die Netzwerke eine Zunahme der Antwort nachG Training durch elektrische Stimulation induziert. Die erhöhte Response wurde als eine Form des Lernens durch Stimuluserkennung betrachtet, wobei die Netzwerke in einer konsistenten Weise auf eine Veränderung des Reizes nach der Anwendung eines spezifischen Stimulations- ( dh Trainings-) Protokolls reagierten.
Dieses Protokoll zeigt, wie man neuronale Zellen auf MEAs kultiviert, erfolgreich von über 95% der überzogenen Teller aufnehmen, ein Protokoll erstellen, um die Netzwerke zu trainieren, um auf Stimulationsmuster zu reagieren, einzelne Einheitsaktivitäten zu sortieren, Histogramme zu zeichnen und die Ergebnisse zu interpretieren Solche Experimente. Die Verwendung eines proprietären Systems (siehe Tabelle der Materialien ) für die Stimulation und Aufzeichnung von neuronalen Kulturen wird gezeigt, ebenso wie die Anwendung von Softwarepaketen (siehe Tabelle der Materialien ), um neuronale Einheiten zu sortieren . Eine kundenspezifische grafische Benutzeroberfläche (siehe Tabelle der Materialien ) dient zur Visualisierung von Post-sTimulus-Zeit-Histogramme, Inter-Burst-Intervalle und Burst-Dauer sowie die zelluläre Antwort auf Stimulation vor und nach einem Trainingsprotokoll zu vergleichen.
Die Schritte, die in diesem Protokoll skizziert werden, liefern genügend Details für den Anfänger, um seine eigenen neuronalen Kulturen auf MEAs zu tafeln und Netzwerkaktivitäten aufzuzeichnen. Dieses Protokoll wird dazu beitragen, dass die Kulturen richtig haften, eine Teppichschicht von Zellen über den Elektrodenarrays bilden und seit Monaten gesund und kontaminationsfrei bleiben.
Obwohl es am besten ist, sich an alle Teile des Protokolls zu halten, gibt es während des gesamten Prozesses Schritte, die für das erfolgreiche Ergebnis entscheidend sind. Die Verwendung von aseptischen Technik während des gesamten Prozesses ist zwingend erforderlich, um zu verhindern, dass die Kulturen kontaminiert werden. Neue MEAs müssen hydrophil gemacht werden, wie im Protokoll beschrieben, oder es kommt zu einer schlechten Zelladhäsion. Durch die Vermeidung von harten Pipettieren und die Bildung von Luftblasen während der Dissoziation wird die Anzahl der beschädigten Zellen reduziert und führt zu einer höheren und gesünderen Ausbeute. Umschalten von DMEM 5/5 auf DMEM + nach dem erstenFütterung ist auch wichtig. DMEM 5/5 enthält Pferdeserum, das Gliazellen dazu veranlasst, die Kultur zu dominieren, wenn sie kontinuierlich verwendet wird und zu einer schlechten neuronalen Aktivität führen wird, obwohl die Kulturen gesund erscheinen werden 17 . Die Fütterung der Kulturen wie geplant und halten sie in ordnungsgemäße Inkubationsbedingungen ist auch entscheidend.
Plating Zellkulturen auf MEAs beinhaltet viele Variablen, die zu weniger als optimalen Ergebnissen führen können. Obwohl das Ziel ein perfekter "Teppich" von Zellen ist, führt das Versagen, die oben erwähnten kritischen Schritte zu lösen, zu einer schlechten Zellreifung oder einer Kontamination. Eine schlechte Zelladhäsion, die sich von der schlechten Zellreifung unterscheidet, ist ebenfalls ein Anliegen. Dies kann durch mehrere Faktoren verursacht werden, einschließlich der schlechten MEA-Vorbereitung vor dem Plattieren oder der Verwendung von altem Medium. Wenn altes Medium eine stabilisierte Form von L-Glutamin und serumfreie Ergänzung für die neuronale Zellkultur enthält (siehe Materialtabelle) Verwendet wird, die Zellen anfangs haften, aber dann schweben nach etwa zwei Wochen. Wenn bakterielle Kontamination ein anhaltendes Problem ist, kann dem Medium ein Antibiotikum, wie Ampicillin oder Pen-Strep, zugesetzt werden. Es gibt auch Fungizide zur Behandlung von Pilzkontaminationen. Dies sind einige der häufigsten Variablen, die das Ergebnis der Kulturen beeinflussen können. Es gibt viele andere, die nur nach Zeit und Erfahrung begegnet werden.
Im Vergleich zur Verwendung von Glasmikroelektroden eignet sich diese Technik hervorragend für das Studium der Netzdynamik und der pharmakologischen Reaktionen. Es ermöglicht die Verwendung von vielen verschiedenen räumlich-zeitlichen Stimulationsmuster und ermöglicht die Aufzeichnung von neuronalen Reaktionen aus mehreren Bereichen auf einmal. Vorherige Gruppen haben interessante Ergebnisse unter Verwendung von Protokollen gezeigt, die den hier beschriebenen ähnlich sind. Da die Kulturen für Wochen oder Monate dauern und die gleichen Kulturen wiederverwendet werden können, ist diese Technik auch einLlows für mehrere Experimente im Laufe der Zeit auf dem gleichen Netzwerk.
Allerdings gibt es Einschränkungen für diese Technik. MEAs sind nicht invasiv. Daher können sie nur extrazelluläre Aktivität aufnehmen, im Gegensatz zu Patch-Clamping oder intrazelluläre Aufzeichnung mit Pipetten. Da außerdem jede Elektrode in einem Array von mehreren Zellen bedeckt ist, ist es nicht möglich, die Aktivität eines einzelnen Neurons zu lösen. Umgekehrt, weil diese in vitro Kulturen sind, können sie nicht vollständig reproduzieren die strukturellen Eigenschaften von Netzwerken im Gehirn. Auch kann die Aktivität nur für weniger als 30 min zu einem Zeitpunkt aufgezeichnet werden, ohne dass ein Mechanismus eine CO & sub2 ; -Atmosphäre für die Zellen zur Aufrechterhaltung ihres pH-Gleichgewichts bereitstellt.
Sobald diese Technik beherrscht wird, können pharmakologische Manipulationen mit oder ohne elektrische Stimulation erforscht werden. Neue Protokolle zum Lernen und Gedächtnisbildung in neuronalen Netzwerken können auch entworfen und getestet werden, zusammen mit pRotationen für Hippocampus- oder Rückenmarksnetze. Protokolle für die Stimulierung und Schulung von Netzwerken wurden zuvor veröffentlicht, und einige von diesen wurden zu in vivo- Protokollen weiterentwickelt, wie die von Eytan et al. Vorgeschlagene "selektive Anpassung" 19 Mehrere Protokolle wurden getestet. Doch nur Ergebnisse aus einer von Ruaro im Jahr 2005 vorgeschlagenen Änderung des Tetanus-Verfahrens sind hier 14 , 20 dargestellt.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation finanziert CMMI-1300007 finanziert. Wir möchten frühere Labormitglieder anerkennen, die mit der Gestaltung dieser Protokolle und mit der Pflege der Kulturen seit über fünf Jahren an der George Mason University geholfen haben: Dr. Joseph J. Pancrazio, Dr. Hamid Charkhkar, Dr. Gretchen Knaack , Dr. Franz Hamilton, Michael Maquera und Robert Graham.
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | Make 4mg/mL aliquots |
B-27 | Invitrogen | 17504-044 | Serum-free supplement for neural cell culture. Make 1 mL aliquots and freeze |
Beakers – glass – 100 mL | VWR | 13912-160 | |
Beakers – glass – 500 mL | VWR | 10754-956 | |
Blunt-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 500365-G | |
Cryogenic vial – sterile, 2 mL | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
Cryogenic vial – sterile, 5 mL | Fisher Scientific | 10-500-27 | |
DMEM with Glutamax | Gibco Life Technology | 10569-010 | Cell culture media that contains a stabilized form of L-glutamine |
DNase | Worthington Biochemical | LK003172 | |
Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2030 | |
Fine-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 501324-G | |
Glass Pipets | VWR | 14673-010 | |
GlutaMAX — I (100X) | Gibco Life Technology | 35050-061 | A stabilized form of L-glutamine used as a suplement |
Hemocytometer chip | Fisher Scientific | 22-600-101 | |
Hibernate EB complete | BrainBits | D00118 | Ambient CO2 cell storage media |
Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12195H | |
Laminin | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
MCS filter amplifier | MultiChannel System | FA60SBC | |
MCS headstage/pre-amplifier | MultiChannel System | MEA1060-INV | |
MCS microelectrode array | MultiChannel System | 60MEA200/10iR-ITO | |
MCS power supply | MultiChannel System | PS20W | |
MCS signal divider | MultiChannel System | SDMEA | |
MCS stimulus generator | MultiChannel System | STG4002 | |
MCS temperature controller | MultiChannel System | TC02 | |
Media storage bottle – glass 500 mL | VWR | 10754-818 | Autoclave |
Microcentrifuge tubes – 0.4 mL | Thermo Fisher | 3485 | Autoclave |
Microcentrifuge tubes – 2 mL | Thermo Fisher | 3434ECONO | Autoclave |
Micropipette tips – 10 uL | VWR | 37001-166 | Autoclave |
Micropipette tips – 1000 uL | VWR | 13503-464 | Autoclave |
Micropipette tips – 200 uL | VWR | 37001-596 | Autoclave |
Micropipetter – 10 uL | Thermo Fisher | 4641170N | |
Micropipetter – 1000 uL | Thermo Fisher | 4641210N | |
Micropipetter – 200 uL | Thermo Fisher | 4641230N | |
Papain – 0.22 Filtered | Worthington Biochemical | LK003178 | |
Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher | 15070063 | |
Petri dishes -100mm disposable | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
Petri dishes -100mm glass | VWR | 10754-788 | |
Petri dishes -35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
Phosphate buffer saline (PBS) (1X) | Corning | 21-040-CV | |
Plasma Cleaning System | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma Aldrich | P6407-5MG | |
Polyethylene conical (centrifuge) tube -15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
Polypropylene conical (centrifuge) tube -50 mL | Falcon | 352070 | |
Procedure masks | Imco | 1530-imc | |
Pyruvate | Sigma Aldrich | P4562-5G | |
Scalpel blades | World Precision Instruments | 500237-G | |
Scissors – iris | World Precision Instruments | 14111-G | |
Scissors – large | World Precision Instruments | 14214 | |
Scissors – small surgical | World Precision Instruments | 501733-G | |
Serological pipette – sterile, 1 mL | VWR | 89130-892 | |
Serological pipette – sterile, 2 mL | VWR | 89130-894 | |
Serological pipette – sterile, 25 mL | VWR | 89130-900 | |
Serological pipette – sterile, 50 mL | VWR | 89130-902 | |
Software: Matlab GUI | Peixoto Lab | npeixoto@gmu.edu | Used to analyze .mat files. Available for free upon request. Contact npeixoto@gmu.edu to request a copy. |
Software: MCS MC_Rack | MultiChannel System | N/A | Used for data acquisition |
Software: NeuroExplorer | Plexon | http://www.plexon.com/products/neuroexplorer | Used to convert .nex files to .mat |
Software: Offline Sorter | Plexon | http://www.plexon.com/products/offline-sorter | Used to sort neural spikes and convert data files to .plx and then to .nex |
Software Manual: MCS MC_Rack | MultiChannel System | https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf | |
Software Manual: NeuroExplorer | Plexon | https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf | |
Software Manual: Offline Sorter | Plexon | www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf | |
Spatula – small double-ended | World Precision Instruments | 503440 | |
Stericup 0.22 µm pore filter – 250 mL | Millipore | SCGVU02RE | |
Transfer pipette – large bore | Thermo Fisher | 335-1S | |
Transfer pipette – small bore | Thermo Fisher | 242-1S | |
Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154-20ML | |
Whatman filter paper | Whatman | 1442 150 | Cut into 8 pie wedges and autoclave in a glass Petri dish |