משלוח מערכתית של MicroRNA באמצעות וירוס רקומביננטי Adeno-הקשורים Serotype 9 לטיפול מחלות נוירומוסקולריות אצל מכרסמים
Summary
כאן נתאר את המסירה של microRNA באמצעות serotype של וירוס רקומביננטי adeno-הקשורים 9 במודל של עכברים של מחלה עצב-שריר. ניהול היקפיים יחידה בעכברים כתוצאה miRNA מתמשכת ביטוי שריר, מוטורי לגלוקוז, מתן הזדמנות טיפולית פוטנציאל vivo בתוךותפקוד miRNA של המחקר.
Abstract
התערבות ב RNA דרך השביל miRNA אנדוגני מסדיר ביטוי גנים על ידי שליטה סינתזה של חלבון באמצעות post-transcriptional ג’ין להחרשת. בשנים האחרונות, הכונה בתיווך miRNA הראו פוטנציאל לטיפול של הפרעות נוירולוגיות הנגרמת על ידי רווח רעילים של מנגנון פונקציה. עם זאת, משלוח יעיל לרקמות היעד מוגבל היישום שלה. כאן השתמשנו דגם העכבר הטרנסגניים עבור ניוון שרירי עמוד השדרה ו- bulbar (SBMA), מחלה neuromuscular הנגרמת על ידי הרחבת polyglutamine ב קולטן האנדרוגן (AR), לבחון את ג’ין להחרשת מאת החדש מזוהה פילוח AR miRNA, מיר-298. אנחנו overexpressed מיר-298 באמצעות וקטור serotype 9 וירוס adeno-הקשורים רקומביננטי (rAAV) כדי להקל על התמרה חושית של אי חלוקת תאים. זריקה אחת וריד הזנב בעכברים SBMA המושרה ביטוי נרחבת ומתמשכת של מיר-298 שרירי השלד, מוטורי לגלוקוז וכתוצאה amelioration של פנוטיפ neuromuscular בעכברים.
Introduction
MiRNAs הם ללא קידוד RNAs, נוקלאוטידים 21-23 אורך, זה תפקיד חשוב ברגולציה של ביטוי גנים, בקרה של מסלולים מגוונים הסלולר וחילוף. 1 ביטוי גנים מוסדר בעיקר על ידי גרימת השפלה להשתיק או mRNA ג’ין post-transcriptional. 2 MiRNAs הם בדרך כלל משלים לאזור 3′ לא מתורגם (UTR) של קידוד גנים, למרות כריכת 5′ UTR וקידוד מחוזות המטרה ש-mrna גם תואר. 3
להבנת התפקידים של miRNA בפתוגנזה של מחלות האדם הנוכחי מתרחב, אפנון תרופתי miRNAs בודדים או משפחות miRNA הוא יותר ויותר אפשרות טיפולית מעשית. לעומת אחרים אסטרטגיות עיכוב RNA, miRNAs יש יתרונות רבים: miRNAs הינם רעילים פחות immunogenic פחות, ניתן בקלות להעביר לתוך תאים בשל גודלם הקטן. 4 , 5 , 6 MiRNAs בדרך כלל יש מטרות רבות בתוך הרשתות הסלולאריות, לכן תופעות מחוץ-יעד האפשריות, חששות בטיחות צריכים להילקח בחשבון, יחד עם משלוח יעיל לרקמות היעד.
מחלות נוירומוסקולריות נרכשים או ירש תנאים המשפיעים על שרירים ועל מוטורי לגלוקוז. כיוון התקפות על סמים כדי שרירי השלד הוא אזור המתעוררים של מחקר, איפה האתגר המרכזי כדי להשיג תפוצה נרחבת בתוך חלון טיפולי. 7 מוטורי לגלוקוז קשים יותר למטרה-בעיקר בגלל סמים גישה זו מנעה ידי מחסום הדם מוח.
תא תרבות ועכבר מודלים של ניוון שרירי עמוד השדרה ו- bulbar (SBMA) השתמשו במחקר זה. SBMA היא מחלה neuromuscular הנגרמת על ידי רווח רעילים של מנגנון פונקציה, שבו מושפעים שרירים והן מוטורי לגלוקוז. 8 , SBMA 9 (המחלה של קנדי; OMIM #313200) היא מחלה X-linked, המאופיינת חולשת שרירים ו ניוון, הנגרמת על ידי חטיבתי הרחבה אני חוזר בגן AR, שמקודד בדרכי polyglutamine המורחבת בהחלבון AR . 10 אין טיפול למחלות שינוי זמין כעת עבור הפרעה זו. המודל העכבר הטרנסגניים השתמשו במחקר זה recapitulates את התכונות של המחלה, לרבות ירידה לפרטים מגדר, מנוע-נוירון פתולוגיה, ניוון שרירים מתקדמת. 11
במחקר זה, המאמצים שלנו התמקדו בזיהוי של miRNA downregulates ביטוי ישירות את transgene AR מוטציה, על עיצוב מצב בטוח ויעיל של מסירת miRNA בחוט השדרה ואת שרירי השלד של המודל העכבר שלנו המחלה.
כאן אנחנו מזוהה יחסית uncharacterized miRNA, miRNA-298 (מספר גישה MIMAT0004901),12 לצמצום ישירות AR מוטציה, ביטוי SBMA מודלים. כדי להשיג את המסירה של מיר-298 לרקמות היעד, השתמשנו אסטרטגיה ויראלי, עם וירוס רקומביננטי adeno-הקשורים serotype 9 (rAAV9). rAAV9 הוא מסוגל לחצות את מחסום הדם מוח, מתווכים גנים לטווח ארוך ללא חלוקת תאים, כולל נוירונים. 13 ניהול מערכתי יחידה של AAV9-מיר-298 הביא בביטוי מתמשכת של miRNA, התמרה חושית יעילה של שרירים, מוטורי לגלוקוז, למטה-רגולציה של הביטוי AR, amelioration של פנוטיפ המחלה בעכברים SBMA. 14 מתודולוגיה זו יכול לשמש כדי לספק miRNA או antagomirs ביטוי ויוו.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנחנו מדגימים מתודולוגיה מאוד יעיל ונגיש לבחור ולהעביר באמצעות זריקת הזנב miRNA באמצעות rAAV9 כמו וקטור ויראלי למטרה שרירי השלד, מנוע הנוירונים בעכברים. 14 לעומת אחרים אסטרטגיות RNAi, miRNAs הם פחות רעילים פחות immunogenic. 18 . בנוסף, גודלם הקטן להפוך אותם המתאימה את קיבולת אריזה מוגבלת של וקטורים ויראלי. 2 אלגוריתמים חישובית כלי חיזוי מאפשרות זיהוי מטרות בשם miRNA-mRNA. ברגע לזיהוי, יש צורך לאמת את ההשפעות של miRNA על ביטוי גנים היעד. גישה משותפת היא overexpress של miRNA נתון במבחנה , לזהות רמות הביטוי של חלבון המטרה באמצעות ניתוח המערבי. 14 , 19
מחקרים שונים השתמשו אסטרטגיות ויראלי נגיפי להעברת miRNAs. 13 כאן השתמשנו adeno-הקשורים וירוס (AAV) ככלי המסירה הגן. לעומת אחרים וקטורים ויראלי, AAV מעורר immunogenicity נמוכות, מאפשר העברה גנטית לטווח ארוך, יש קשת רחבה של tropism חלוקת ללא חלוקת תאים. 18 שיטת העברה זו גם לעקוף את הצורך שינוי כימי שעשויים להשפיע על פונקציונליות וספציפיות של מולקולת ה-RNA. ישנם מספר אשר נגרמו מהזנים אליהם של AAV, אלה נקבעים בעיקר על ידי ההרכב של החלבונים capsid. אלה אשר נגרמו מהזנים אליהם נבדלים שלהם tropism, מגלי סוגי תאים שונים. זה הכרחי לבחור את serotype הנכון כאשר בוחנים את רקמת המטרה. בחרנו rAAV9, בגלל היעילות שלה התמרה חושית גבוהה במערכת העצבים המרכזית ואת שרירי השלד בעקבות ניהול היקפיים19,20. גישה זו הראו להתייעלות התמרה חושית בבעלי neonatal בהשוואה למבוגרים בעלי חיים, ככל הנראה בגלל הבדלים קומפוזיציה מטריצה חוץ-תאית, נוירון-כדי-עכשיו, דונלד יחס ובגרות של המחסום הדם-המוח. 21 , 22
צעד חשוב ב פרוטוקול זה הוא העיצוב של וקטור הביטוי. בהשוואה bicistronic וקטורים, אשר מונעים על ידי ביטוי התחתון של הגן השני לעומת הגן הראשון לצד ייצוג המקדם, הווקטור כפול המקדם מאפשרת תצורה גב אל גב מניב ביטוי גבוהה הן miRNA והן EGFP, ובכך המאפשר לוקליזציה של miRNA העכבר רקמה על-ידי immunofluorescence.
AAV9 תוך ורידיות הביא התמרה חושית הומוגנית ברקמות היעד, שרירי השלד ולאחר מוטורי לגלוקוז ויעילות גבוהה. המסלול של הזרקת מאפשר את המינון מנוהל להגיע את מחזור מערכתי, לחצות את מחסום הדם מוח, וזה חשוב עבור טיפולים מיקוד על מערכת העצבים המרכזית. יתר על כן, היא שיטה לא פולשנית למסירה מערכת העצבים. MiR-298 הביטוי עלה ב חוט השדרה ואת שריר אחרי 2-4 שבועות עם זריקה אחת היקפיים רוב בגיל 5 שבועות. כאשר באמצעות גנום חד גדילי AAV וקטורים, סינתזה דה נובו של סטרנד DNA השני עשוי להסביר התמרה חושית מושהית. 23
רמות של מיר אנושי-298 היו בלתי מורגשת אצל עכברים שטופלו 20 שבועות לאחר ניהול יחידה, רומז כי למחלות כרוניות, זריקות מרובות עשוי להיות נדרש כדי להגיע יתרון טיפולית. עם זאת, להיות הגבלת miRNA השפלה לאורך זמן כאשר המינהל חוזרות ונשנות לכל החיים נדרשת. בנוסף, חסינות מסתגלת AAV וקטורים יכולים ליצור מחסום אחר משלוח גנים מוצלחים. 24 וכך דור של הווקטורים AAV שהם מבינים immunologically חיונית עבור מינהל חוזרות והשגת השפעות ארוכות טווח עם מערכת משלוח מבטיח זו. 25
הגבלה על השימוש של miRNA כאסטרטגיה טיפולית היא הסיכון של תופעות מחוץ-יעד. MiRNAs שדואגים דרך הבסיס incomplementary זיווג עם תעתיקים גנים אחרים, אשר מהווה סיכון בטיחות עם גישה זו. שיפור בעיצוב של הרצף RNAi, לרבות השימוש miRNAs קאנונית, כגון mirtrons, אשר לעקוף את המתחם מיקרו-מעבד, מקיף מחקרים ארוכי טווח הבטיחות והסבילות הם קריטיים לפני לתרגם אסטרטגיה זו כספת ו טיפול יעיל. 26 , 27 , 28
השיטה המתוארת כאן פותחה במקור עבור ביטוי miRNA, אבל זה גם יכול להיות מנוצל עבור miRNA עיכוב טיפול באמצעות antagomirs.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים. אנו מודים SignaGen מעבדות (Rockvile, MD, ארצות הברית) עבור הייצור וירוס AAV9. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מחקר מגזר NINDS, NIH. פיליפ ר. לי נתמכה על ידי בכספי החלוקה של מגזר מחקר של NICHD. קרלו Rinaldi נתמכה על ידי התחברות מ- les חדר מרווח וחדיש האגודה הצרפתית Myopathies (AFM).
Materials
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Lysis of fatty and standard tissues before RNA isolation |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | Purification of miRNA and total RNA |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit | ThermoFisher Scientific | 4366596 | A highly specific kit that quantitates only mature miRNAs |
| snoRNA202 Primer | ThermoFisher Scientific | 1232 | Taqman miRNA control assay in mouse |
| miR-298 Primer | ThermoFisher Scientific | 2190 | Taqman miRNA-298 assay in mouse |
| Anti-GFP antibody | abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP – ChIP Grade |
| Red ink pad | Dovecraft Essentials | ||
| Blue ink pad | Dovecraft Essentials | ||
| AAV9-GFP vector | SignaGen Laboratories | SL100840 | Large scale AAV plasmid construction, packaging and purification |
| mmu-miR-298-5p | ThermoFisher Scientific | MC12525 | mirVana miRNA mimic |
| AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP | Vector Biosystems Inc |
References
- Broderick, J. A., Zamore, P. D. miRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104-1110 (2011).
- Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nat Rev Genet. 12, 861-874 (2011).
- Pickering, B. M., Willis, A. E. The implications of structured 5′ untranslated regions on translation and disease. Semin Cell Dev Biol. 16, 39-47 (2005).
- Bilen, J., Liu, N., Burnett, B. G., Pittman, R. N., Bonini, N. M. MicroRNA pathways modulate polyglutamine-induced neurodegeneration. Mol Cell. 24, 157-163 (2006).
- Lee, Y., Samaco, R. C., Gatchel, J. R., Thaller, C., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. miR-19, miR-101 and miR-130 co-regulate ATXN1 levels to potentially modulate SCA1 pathogenesis. Nat Neurosci. 11, 1137-1139 (2008).
- Liu, N., et al. The microRNA miR-34 modulates ageing and neurodegeneration in Drosophila. Nature. 482, 519-523 (2012).
- Ebner, D. C., et al. Strategies for skeletal muscle targeting in drug discovery. Curr Pharm Des. 10, 1327-1336 (2015).
- Giorgetti, E., Lieberman, A. P. Polyglutamine androgen receptor-mediated neuromuscular disease. Cell Mol Life Sci. 73, 3991-3999 (2016).
- Grunseich, C., Rinaldi, C., Fischbeck, K. H. Spinal and bulbar muscular atrophy: pathogenesis and clinical management. Oral Dis. 20, 6-9 (2014).
- La Spada, A. R., Wilson, E. M., Lubahn, D. B., Harding, A. E., Fischbeck, K. H. Androgen receptor gene mutations in X-linked spinal and bulbar muscular atrophy. Nature. 352, 77-79 (1991).
- Katsuno, M., Adachi, H., Kume, A., Li, M., Nakagomi, Y., Niwa, H., Sang, C., Kobayashi, Y., Doyu, M., Sobue, G. Testosterone reduction prevents phenotypic expression in a transgenic mouse model of spinal and bulbar muscular atrophy. Neuron. 35, 843-854 (2002).
- Boissonneault, V., Plante, I., Rivest, S., Provost, P. MicroRNA-298 and microRNA-328 regulate expression of mouse beta-amyloid precursor protein-converting enzyme 1. J Biol Chem. 284, 1971-1981 (2009).
- Choudhury, S. R., et al. Widespread central nervous system gene transfer and silencing after systemic delivery of novel AAV-AS vector. Mol Ther. 24, 726-735 (2016).
- Pourshafie, N., et al. MiR-298 counteracts mutant androgen receptor toxicity in spinal and bulbar muscular atrophy. Mol Ther. 24, 937-945 (2016).
- Dweep, H., Sticht, C., Pandey, P., Gretz, N. miRWalk–database: prediction of possible miRNA binding sites by "walking" the genes of three genomes. J Biomed Inform. 44, 839-847 (2011).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Stuard, D. A., Oorschot, D. E. Embedding, sectioning, immunocytochemical and stereological methods that optimise research on the lesioned adult rat spinal cord. J Neurosci Methods. 61, 5-14 (1995).
- Huang, F., et al. miR-25 alleviates polyQ-mediated cytotoxicity by silencing ATXN3. FEBS Lett. 588, 4791-4798 (2014).
- Kuhn, D. E., Martin, M. M., Feldman, D. S., Terry, A. V., Nuovo, G. J., Elton, T. S. Experimental validation of miRNA targets. Methods. 44, 47-54 (2008).
- Yang, N. An overview of viral and nonviral delivery systems for microRNA. Int J Pharm Investig. 5, 179-181 (2015).
- Bourdenx, M., Dutheil, N., Bezard, E., Dehay, B. Systemic gene delivery to the central nervous system using Adeno-associated virus. Front Mol Neurosci. 7, 50 (2014).
- Foust, K. D., Nurre, E., Montgomery, C. L., Hernandez, A., Chan, C. M., Kaspar, B. K. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
- Wang, Z., Ma, H. -. I., Li, J., Sun, L., Zhang, J., Xiao, X. Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Therapy. 10, 2105-2111 (2003).
- Saunders, N. R., Joakim Ek, C., Dziegielewska, K. M. The neonatal blood-brain barrier is functionally effective, and immaturity does not explain differential targeting of AAV9. Nat Biotechnol. 27, 804-805 (2009).
- Boudreau, R. L., Spengler, R. M., Davidson, B. L. Rational design of therapeutic siRNAs: minimizing off-targeting potential to improve the safety of RNAi therapy for Huntington’s disease. Mol Ther. 19, 2169-2177 (2011).
- Duque, S., Joussemet, B., Riviere, C., Marais, T., Dubreil, L., Douar, A. M., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17, 1187-1196 (2009).
- Lowenstein, P. R. Crossing the rubicon. Nat Biotechnol. 27, 42-44 (2009).
- Sibley, C. R., Seow, Y., Curtis, H., Weinberg, M. S., Wood, M. J. Silencing of Parkinson’s disease-associated genes with artificial mirtron mimics of miR-1224. Nucleic Acids Res. 40, 9863-9875 (2012).
