Isolering af Side Population i Myc-induceret T-celle akut lymfoblastisk leukæmi i zebrafisk
Summary
Her beskriver vi en teknik til isolering af sidebefolkningscellerne fra en zebrafiskmodel af myc-induceret T-celle akut lymfoblastisk leukæmi (T-ALL). Denne sidebestemmelsesanalyse er meget følsom og er beskrevet for zebrafisk T-ALL, men den kan være anvendelig for andre maligne og ikke-maligne zebrafiskcelletyper.
Abstract
Heterogene cellepopulationer, fra enten raske eller maligne væv, kan indeholde en population af celler kendetegnet ved en differens evne til udstrømning DNA-bindende farvestof Hoechst 33342. Denne "side population" af celler kan identificeres under anvendelse af flow-cytometriske metoder efter Hoechst 33342 farvestof er begejstret ved en ultraviolet (UV) laser. Den side population af mange celletyper indeholder stem- eller progenitor-celler. Men ikke alle celletyper har en identificerbar side befolkning. Danio rerio, zebrafisk, har en robust in vivo model af T-celle akut lymfoblastisk leukæmi (T-ALL), men om disse zebrafisk T-alls har en side befolkning er ukendt. Den her beskrevne metode skitserer, hvordan man isolere side population celler i zebrafisk T-ALL. Til at begynde, er T-ALL i zebrafisk genereret via mikroinjektion af tol2 plasmider i en celle embryoer. Når tumorerne er vokset til et stadium, hvor de udvide til mere end halvdelen af animal krop, kan de T-ALL-celler høstes. Cellerne farves derefter med Hoechst 33342 og undersøgt ved flowcytometri til side population celler. Denne metode har brede anvendelser i zebrafisk T-ALL forskning. Mens der er ingen kendte celleoverflademarkører i zebrafisk, der bekræfter, om disse side population celler er cancer stamcelle-lignende, in vivo funktionelle transplantationssystemerne assays er mulige. Desuden kunne encellede transcriptomics anvendes til at identificere de genetiske træk ved disse side population celler.
Introduction
Den side befolkning assayet udnytter den forbedrede evne af visse celler i et væv til udstrømning det DNA-bindende farvestof Hoechst 33342 som følge af høje niveauer af ATP-binding cassette (ABC) transportproteiner på cellemembranen. De celler, der efflux Hoechst 33342 farvestoffet kan identificeres under anvendelse dobbelt bølgelængde flowcytometrisk analyse efter farvestoffet exciteres med en UV-laser. Dette assay blev først anvendt til at identificere murine hæmatopoietiske stamceller (HSC'er) 1, men det er siden blevet anvendt til at identificere stamceller / progenitor cellepopulationer i mange væv og cancer (gennemgået i reference 2). Men ikke alle populationer af celler har en side befolkning, og ikke alle bivirkninger populationer beriget for stamceller / progenitorceller.
Zebrafisken er en kraftfuld hvirveldyr genetisk modelsystem til forskning i menneskers kræft 3, 4, med en række fordele frem for traditionelle murine moDels af kræft. Zebrafish embryoner er eksternt befrugtede og er optisk klare, letter transgenese og in vivo observation af patologiske processer, herunder kræftinitiering og progression. Hidtil har sidebestemmelsesassayet til at detektere potentielle stamme- eller stamceller kun været anvendt på nyremarven i zebrafisk for at identificere HSC'er og ikke til nogen zebrafiskkræftmodeller 5 , 6 .
Zebrafish-modellen af T-celle akut lymfoblastisk leukæmi (T-ALL) er morfologisk og genetisk ligner humant T-ALL 7 , 8 , 11 . T-ALL er en aggressiv malignitet, som hos mennesker tegner sig for 10-15% af pædiatriske og 25% af voksne ALL-tilfælde 9 . Mens behandlingen af T-ALL er forbedret, er tilbagefald stadig almindeligt og er forbundet med en dårlig prognose. T-ALL-tumorer er heterogeneOus og indeholder mange forskellige tumorcelle-subpopulationer, herunder leukæmi-initierende celler (LIC'er). LIC'er er defineret ved deres evne til at genvinde hele tumoren fra en enkelt celle, og hyppigheden af LIC'er i en tumorcellepopulation kan beregnes ved at transplantere varierende celledoser til recipienter via en begrænsende fortyndingstransplantationsassay (LDA). Mens LDA eksperimenter er blevet udført i zebrafisk for at beregne frekvensen af LICs 8 , 10 , 11 , er denne bestemmelse foretaget i eftersyn og tillader ikke den fremtidige isolering af LIC'er. Derfor mangler en metode til prospektivt isolering af en population beriget for kræft stamcelleaktivitet. Identifikation og isolering af sidebefolkningsceller fra zebrafisk T-ALL er det første skridt i retning af at afhjælpe denne mangel.
Den her præsenterede protokol beskriver, hvordan man effektivt genererer T-ALL-tumorer i zebrAfish ved hjælp af tol2-medieret transgenese, høst T-ALL-tumorcellerne og farvene dem med Hoechst 33342 for at identificere sidepopulationen af celler. Fremtidige in vivo eksperimenter med zebrafisk T-ALL kunne indeholde, om sidebefolkningscellerne er beriget for LIC'er eller har andre stam- eller stamcellerlignende egenskaber.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den side befolkning analysen er meget følsomme; derfor kan små ændringer i protokollen resultere i en vanskeligt at opdage side population celler. Først er temperaturen under farvningen trin er specifik for hvert dyr / cellesystem. For mammale systemer er den side befolkning assayet udføres typisk ved 37 ° C 2. Når zebrafisk T-ALL-celler blev inkuberet ved 37 ° C, mange af cellerne døde, hvilket gjorde denne inkubationstemperatur uacceptabelt (data ikke vist). Når Kobayashi og kolleger …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af University of Chicago Kvinders bestyrelsen, Wendy Will sag fond, og University of Chicago Omfattende Cancer Center Support Grant (P30 CA014599). Vi vil gerne takke flowcytometri Core på University of Chicago for deres hjælp til opsætning dette eksperiment, og såvel som andre medlemmer af de Jong laboratorium, især Leslie Pedraza og Sean McConnell.
Materials
| Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
| rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
| rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
| pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
| NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
| mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific – AM1340 | 25 reactions |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
| SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
| Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
| Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
| Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
| Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
| Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
| Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific – NC0342409 | 100 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific – SH3007103 | 500 mL |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) – 500 mL |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 – 300 unit vials |
| 40 um mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
| Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL – Solution (0.4%) |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
| Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |
References
- Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8, 136-147 (2011).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111 (3), 1131-1137 (2008).
- Tsinkalovsky, O., Vik-Mo, A. O., Ferreira, S., Laerum, O. D., Fjose, A. Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties. Differentiation. 75 (3), 175-183 (2007).
- Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299, 887-890 (2003).
- Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. J Vis Exp. , e2790 (2011).
- Martelli, A. M., et al. Targeting signaling pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cells. Adv Biol Regul. 56, 6-21 (2014).
- Smith, A. C. H., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
- Blackburn, J. S., et al. Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in T cell acute lymphoblastic leukemia through Akt/mTORC1 pathway activation. Cancer Cell. 25, 366-378 (2014).
- . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. JoVE Science Education Database. , (2016).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. 癌症研究. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , (1993).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct “side population” of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci. USA. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Komuro, H., et al. Identification of side population cells (stem-like cell population) in pediatric solid tumor cell lines. J Pediatr Surg. 42 (12), 2040-2045 (2007).
- Moshaver, B., et al. Identification of a small subpopulation of candidate leukemia-initiating cells in the side population of patients with acute myeloid leukemia. Stem Cells. 26 (12), 3059-3067 (2008).
