Nörotoksisite Testi İçin İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Nöronlar ve Glia Karışık Kültürlerine Ayrıştırılması Protokolü

1. İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre (hiPSC) Genleşmesi NOT: hiPSC'ler mTeSRl 5x takviyeleri içeren mTeSR1 ortamı varlığında (üreticinin talimatlarına göre hazırlanmış plakaya ~ 100 koloni fragmanları / 60 mm Petri kabı) uygun bir protein karışımı substratı üzerinde kültürlenebilir. HiPSC kolonileri uygun bir boyuta ulaştığında ( Şekil 2A'daki bir koloni örneğine bakın), hücreleri aşağıda anlatıldığı gibi (haftada bir kez) geçirin. HESC-nitelikli bazal membran matrisi (bundan sonra "nitelikli matris" olarak adlandırılır) veya herhangi bir uygun protein substratı ile kaplama. Soğuk 1,5 mL tüpler ve soğuk 5 veya 10 mL'lik pipetlerde 200 μL'lik alikotlar halinde , -80 ° C'de nitelikli matrisi ( Malzeme Listesine bakın ) saklayın . Geçişten önce, buz üzerinde 200 μL nitelikli matrisi çözdürün. 200 mcL nitelikli matris 20 m'de seyreltinL DMEM / F12 ortamı (1: 100 seyrelti). Bu solüsyon ile 60 mm Petri kaplarını kaplayın (5 mL / çanak). Kaplanmış tabakları 37 ° C'de en az 1 saat inkübe edin. HiPSC koloni fragmanı kriyoprezervasyon ve çözülme HiPSC kolonileri kesildikten sonra (hiPSC koloni kesim prosedürü için adım 1.3'e bakın), hiPSC koloni parçalarını kök hücre dondurma ortamında, ~ 100 fragman / 250 μL (Malzeme Tablosuna bakınız) nazikçe ve yavaşça tekrar süspanse edin. Kriyoprezervasyon için uygun şişelerde koloni parçalarını alın (250 uL / ​​flakon). Şişeleri 2-propanol dolu bir kaba yerleştirin ve kabı -80 ° C'de en az 2 saat ve en fazla 2 hafta süreyle yerleştirin. Şişeleri bir sıvı azot tankının buhar fazına aktarın. Kültürü yeniden başlatmak için, 1 adet dondurulmuş flakonu su banyosunda 37 ° C'de çözdürün. 7 mL önceden ısıtılmış komple hiPSC içinde hafifçe hiPSC koloni parçalarını toplayın1, 2 veya 5 mL'lik bir pipet kullanarak 15 mL'lik bir tüp içinde orta (bakınız Malzeme Tablosu ). HiPSC koloni parçalarını 130 xg'de 3 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı çıkarın ve 1, 2 veya 5 mL'lik bir pipet kullanarak 1 mL'lik komple hiPSC ortamında hiPSC koloni parçalarını hafifçe tekrar süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 3 veya 4 mL komple hiPSC ortamda seyreltin. Kaliteli bir matris ile kaplanmış 60 mm'lik Petri kabına (~ 100 parça / çanak; adım 1.1'de anlatıldığı gibi tabakları kaplayın) hiPSC koloni parçalarını plaklayın. HiPES'leri 37 ° C'de ve% 5 CO 2'de inkübe edin. Her gün orta düzeyde bir değişiklik yapın. HiPSC kolonilerinin geçişi NOT: Farklılaşmamış hiPSC'ler büyük nükleolide ve bol sitoplazma şekli ile yuvarlak olmalıdır. Ayırt edilmemiş koloniler, düz ve sıkı dolaşan bir morfoloji ile karakterize edilmelidir. Sadece ayrışmamış koloniler (yaklaşık 1 mm iN çap) daha pasaj için kesilmelidir. Kök hücre kolonilerini 30G'lik bir iğne veya diğer ticari olarak temin edilebilir aletler bulunan 1 mL'lik bir şırınga kullanarak yaklaşık 200 μm x 200 μm kareler halinde kesin (Malzeme Tablosuna bakın). Oda sıcaklığında laminer bir kabin içinde 4 kat büyütmede bir stereoskopik mikroskop kullanın. Parçaları kaldırmak için yavaşça altına besleyerek 200 μL'lik bir pipet kullanarak çanak yüzeyinden koloni parçalarını ayırın. Koloni parçalarını (~ 100 parça), 4 mL'lik komple hiPSC ortamı ile dolu, nitelikli bir matriks-DMEM / F12 kaplı plakaya aktarın (Malzemelerin Tablosuna bakın, kapları adım 1.1'de tarif edildiği gibi kaplayın). Yeni plakaları 37 ° C'de ve% 5 C02'de inkübe edin. Her gün toplam orta değişim gerçekleştirin ve 4X ve 10X büyütmede bir faz-kontrast mikroskopu kullanarak kolonilerin morfolojisini inceleyin. 2. HiPSC DiffereKarışık Nöronlar ve Glia'ya ntiasyon NOT: İşlemin tamamlanması yaklaşık 28 gün sürer, ana adımlar Şekil 1'de (üst kısımda) özetlenmiştir. Şekil 1: Nöronal Farklılaşma Protokolünün Şematik Temsil Edilmesi. (Üst kısım) IMR90-hiPSC kolonileri, embriyonik gövdeleri (EB'ler) oluşturmak için fragmanlara kesilebilir. In vitro (DIV) 2 gün sonra EB'ler, laminin veya standart matris kaplı kaplara kaplanabilir ve nöroektodermal türevler (burada nestin (yeşil) ve β için boyanan rozetler) üretmek için nöroepitelyal indüksiyon (NRI) ortamı varlığında kültürlenebilir -III-tübülin (kırmızı)). Rosettes ayrıştırabilir, toplanır, laminin veya standart matris kaplı tabaklar üzerinde replike edilebilir ve ayrıca olgun nöronal (NF200, kırmızı) ve glial olarak ayırt edilebilir(GFAP, yeşil) hücrelerin nöronal farklılaşma (ND) ortamı varlığında. (Alt bölüm) rozet türevi NSC'ler (nestin, kırmızı) nöral indüksiyon (NI) ortamı varlığında genleşebilir, dondurulmuş olarak saklanabilir veya karışık nöronal (NF200, yeşil) ve glial oluşturmak için ND ortamı varlığında daha da farklılaştınlabilir GFAP, kırmızı) kültürleri. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Embriyoid cisimlerin üretimi (Günler 0 → 1) NOT: Bu prosedür, iyi manuel beceri ve hassaslık gerektirir. HiPSC koloni fragmanları bir sonraki adımlarda homojen embriyot gövdeleri (EB'ler) elde etmek için eşit büyüklükte olmalıdır. Morfolojik olarak farklılaşmış koloniler (büyük sitoplazmik fraksiyonlar ve küçük nükleolide) atılmalıdır. Farklılaşmamış hiPSC kolonilerini kesmeden önce hiPSC ortamını (3 mL / 60 mm petri kabı) yenileyin (diamin yaklaşık 1 mm'siEter, bakınız Şekil 2A ) steril koşullar altında (1. adımda tarif edildiği gibi). 30G iğne ile 1 mL'lik bir şırınga kullanarak yaklaşık 200 μm x 200 μm'lik parçalara ayrışmamış kolonileri kesin ( Şekil 2A ve Şekil 2B'de gösterildiği gibi). Oda sıcaklığında laminer bir akış dolabında 4X büyütmede bir stereoskopik mikroskop kullanın. Parçaları kaldırmak için yavaşça orta altına pipetleme yapılarak 200 μL'lik bir pipet kullanarak bulaşık yüzeyinden koloni parçalarını ayırın. Tüm ayrılmış parçaları ve ortam 1, 2 veya 5 mL pipet kullanarak 15 mL'lik bir tüp içine aktarın. Tüm parçaları kurtarmak için çanağı 2 mL eksiksiz hiPSC ortamı ile durulayın. 1 dakika 112 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı aspire edin ve parçaları 5 mL'lik komple hiPSC EB ortamında hafifçe yeniden süspansiyon haline getirin (Malzeme Tablosuna bakın ). Plaka koLony parçaları 60 mm'lik ultra düşük bağlanmış bir Petri kabında (5 mL / 60 mm Petri kabı) ekledi. Petri kabı gece boyunca 37 ° C'de ve% 5 C02'de inkübe edin. Ertesi gün (1. Gün), 1, 2 veya 5 mL'lik bir pipet kullanarak EB'leri ve bunların ortamını 15 mL'lik bir tüp içerisinde toplamayın. EB'leri 112 xg'de 1 dakika boyunca santrifüjleyin. Dikkatle süpernatantı aspire edin ve 1, 2 veya 5 mL'lik bir pipet kullanarak 5 mL'lik komple hiPSC EB ortamında EB'leri yavaşça tekrar süspanse edin. EB'leri yeni bir 60 mm ultra düşük ekli Petri kabı (5 mL / 60 mm Petri kabı) üzerine yerleştirin. Petri kabı gece boyunca 37 ° C'de ve% 5 C02'de inkübe edin. Gün 1'de, bulguları temel membran matrisi ( örn., Matrigel, bundan sonra "standart matris" olarak anılacaktır) veya başka herhangi bir uygun protein substratı ( örn ., Laminin) ile kaplayın. Standart matrisi ( Malzeme Listesine bakın ) -80 ° C'de saklayın.Soğuk 1.5 mL tüpler ve soğuk 5 veya 10 mL'lik pipetleri kullanarak 200 uL'lik alikotlar. Buz üzerinde 200 μL standart matrisi çözünür. Standart matris 200 mcL 20 ml DMEM / F12 orta (1: 100 seyreltme) sulandırınız. Bu solüsyon ile 60 mm Petri kaplarını kaplayın (5 mL / çanak). Kaplanmış yemekleri gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin. NOT: Bu yemekler EB'leri plaklamak (yaklaşık 50 EB / çanak) ve nöroepitelyal agrega (rozet) üretmek için kullanılacaktır; Adım 2.3'e bakın. Nöroepitelyal agrega (rozet) üretimi (2. gün → 7 gün) 2. Gün, 60 mm'lik Petri kaplarından standart matris kaplama solüsyonunu çıkarın (plakları durulamaya gerek yoktur) ve bunları 5 mL / çanak komple nöroepitelyal indüksiyon ortamı (NRI) ile doldurun; Malzeme Tablosu'na bakın . Bir stereoskopik mi altındaki bir 200 | ig pipet kullanarak kayan EB'leri (adım 2.1.14'ten) kaplanmış bulaşıklara (~ 50 EB / çanak) aktarın4x büyütmede croscope ve laminer bir akış dolabına yerleştirilir. NOT: Homojen, orta büyüklükte EB'ler (~ 200-300 μm çapında) seçmek önemlidir. Çok küçük EB'ler nöroektodermal diferansiyasyon sırasında iyi bir şekilde ayakta kalamazken, çok büyük EB'ler çekirdek nekroza uğrar. Bulguları 37 ° C'de ve% 5 CO 2'de inkübe edin. Günler sonra (3. Gün), EB'lerin hepsinin bağlı olduğundan emin olmak için 10x büyütmede mikroskop altındaki bulguları kontrol edin. Komple NRI aracı ile nazikçe toplam orta değişiklik yapın. NRI ortamını her gün nöroepitelyal agregalar (rozetler) görülebilecek 7 güne kadar değiştirin. 7. günde adım 2.2'de tarif edildiği gibi standart matrisi (veya laminin) kaplayınız; 96 oyuklu plakalar (100 uL / ​​oyuk), 24 oyuklu plakalar (250 mcL / oyuk), 12- (500 μL / çukur), MEA cipsi (elektriksel aktivite için, 1 mL / tekli çip) veya 60 mm Petri disheS (4 mL / çanak) ilave edildi. Kaplanmış plakaları 37 ° C'de ve% 5 C02'de en az 2 saat inkübe edin. Rosette ayrılması ve nöronal farklılaşma (8. gün → 28 gün) NOT: Bu prosedür, iyi manuel beceri ve hassaslık gerektirir. Mezodermal ve endodermal hücrelerin toplanmasını önlemek için sadece ektoderm rozet benzeri yapıların ayrışması ve toplanması gerekir. 8. günde, rozet benzeri yapıları steril koşullar altında 10X büyütmeyle bir stereoskopik mikroskop altında parçalara kesin. 30G iğneli 1 mL şırınga kullanın. İğne ile dokunulduğunda rozetlerin çanaktan kolaylıkla ayrılma eğiliminde olduklarına dikkat edin. 200-μL'lik bir pipet kullanarak rozet parçalarının ayrılmasını tamamlayın. Çanağı laminer akış davlumbazının altına aktarın ve 1, 2 veya 5 mL pipet kullanarak rozet parçalarını ve ortamlarını 15 mL'lik bir konik tüp içine alın. Kurutmak için çanağı 2 mL NRI ortamı ile durulayınTüm parçalar. Rozet parçalarını 112 xg'de 2 dakika döndürün. Süpernatantı aspire. Pelet 1 mL 1x DPBS'de (kalsiyum ve magnezyum olmadan) yavaşça tekrar süspansiyon haline getirin ve rozet parçalarını kısmen ayrıştırmak için 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak aşağı yukarı pipetleyin. 4 mL komple NRI ortamı ekleyin ve tripan mavisi ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın (Malzeme Tablosuna bakın ) NOT: 20 μL hücre süspansiyonunu 20 μL Tripan mavisi ile seyreltin. Hücreler tek hücreli bir süspansiyon haline getirilemezse, bu adım atılabilir. Rozet parçaları tamamen ayrışmış görünmüyorsa, yaklaşık 50 EBs / 60 mm çanaktan türetilen rozet parçaları, Tablo 1'de belirtildiği üzere, 50 mL tamamlanmış NRI ortamında yeniden süspansiyon haline getirilebilir ve kaplanabilir. Petri tabaklarından, plakalarından ve / veya MEA cipslerinden standart matris (veya laminin) kaplama solüsyonunu aspire edin (adım 2.3'ten.7). Onların kurumasına izin verme. Çalışma planına göre hücreleri komple NRI ortamında plaklayın (yaklaşık 15.000 hücre / cm2, kaplama hacmi göstergeleri için Tablo 1'e bakın). Plakaları gece boyunca 37 ° C'de ve% 5 C02'de inkübe edin. 10. günde, tam nöronal farklılaşma ortamı (ND) kullanarak toplam orta değişim gerçekleştirin; Malzeme Tablosu'na bakın. 28. güne kadar haftanın her günü ND medyasını yenileyin. Adım 5'te açıklandığı gibi nöronal / glial hücre türevlerini karakterize edin (genel kabul kriterleri için Tablo 2'ye bakın). 3. HiPSC'den türetilmiş Sinirsel Kök Hücre (NSC) Genişletme ve Karışık Nöronlar ve Glia'ya Farklılaşma NOT: Rozet parçacıklarından türetilen NSC'ler, aşağıda açıklanan prosedürü izleyerek genişletilebilir ve muhafaza edilebilir ( Şekil 1 , alt kısım). Bu sayımın artmasını sağlar.Farklılaşma ve kimyasal testler için hücre sayısı. 5 mL standart matris DMEM / F12 kaplama çözeltisi ile 60 mm'lik bir Petri kabını (veya bir T-25 şişesi) kaplayın ve en az 2 saat süreyle 37 ° C'de ve% 5 CO 2'de inkübe edin (adım 2.2'de açıklandığı gibi). 1-2. Adımlardan türetilen rozet parçalarını, 112 xg'de konik bir 15 mL'lik tüp içerisinde 2 dakika boyunca döndürün. 5 mL nötr indüksiyon ortamında (NI) nazikçe topağı tekrar süspanse edin; Malzeme Tablosu'na bakın. Hücreleri, standart bir matris kaplı 60 mm Petri kabı (veya T-25 şişesi) üzerine aktarın. Kültür rozet türevi NSC'ler, NI ortamı varlığında, hücreleri konfluansa gelene kadar besiyeri her geçen gün yenilemektedir. Birleştiğinde MGK'ları aşağıdaki adımlarda anlatıldığı şekilde geçirin. NOT: MGK'ları haftada bir kez geçirin; Çalışma planına bağlı olarak yeni kaplamalı tabaklar, şişeler veya tabaklar kullanmayı düşünün. Tüm NI orta ve zararlı maddenin çıkarılmasıNSC'leri DPBS ile durulayın (kalsiyum ve magnezyum olmadan). Hücreleri içeren 60 mm Petri kabı (veya T-25 şişesi) 37 ° C'ye önceden ısıtılan 1.5 mL% 0.05'lik tripsin-EDTA ilave edin ve 1 dakika boyunca kuluçka makinesine yerleştirin. Hücreleri ayırmak için hafifçe çanağa (veya balona) dokunun. 37 ° C'ye önceden ısıtılan 1.5 mL tripsin önleyicisini ekleyin ve hücreleri 15 mL tüpe aktarın. Petri kabını (veya T-25 şişesini) eşit miktarda NI maddesiyle (1.5 mL) durulayın ve hacmi aynı 15 mL'lik tüp içinde toplamayın. Hücreleri 130 x g'de 3 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı kaldırın ve 1000 μL'lik bir pipet kullanarak 1 mL'lik tam NI ortamında hücreleri nazikçe tekrar süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 3 veya 4 mL'lik komple NI ortamda seyreltin ve tripan mavisi ve otomatik hücre sayıcısı kullanarak hücreleri sayın. NSC'leri adım 3.1'den yaklaşık 50.000 hücre / cm2'lik bir yoğunlukta 60 mm'lik Petri kabına (veya T-25 şişesine) plaka edin. <li> Her geçen gün eksiksiz NI aracı ile toplam orta değişiklik yapın. Adım 5'te açıklandığı gibi hücrelerin nöronal / glial hücre türevleri varlığı için karakterize edin. NOT: NSC'ler komple ND ortamında (2.4.11-2.4.13 adımlarında anlatıldığı gibi) nöronlar ve glia karışık kültürlerine ayırt edilebilir, 21 günlük süre boyunca haftada iki kez komple yenileyebilir. 4. HiPSC türevli NSC Kriyoprezervasyon ve Çözdürme NOT: Geçiş esnasında, NSC'ler bu prosedürü izleyerek dondurulabilir ve yeniden çözülür. Paslanmaz NSC'leri (adım 3.12'den itibaren) 130 xg'de 3 dakika boyunca santrifüjleyin. NOT: Hücreler adım 3.14'te sayılmalıdır. NSC'leri yavaşça ve yavaşça 3 x 10 6 / mL dondurucu ortamda yeniden süspansiyon haline getirin (Malzeme Tablosuna bakın ). Kriyoprezervasyon için uygun tüplerdeki hücreleri ayırın (yaklaşık 0.5 mL = 1.5 x 106 / şişe). Şişeleri bir kutuya yerleştirin fi2-propanol ile doldurulur ve kabı -80 ° C'de en az 2 saat ve en fazla 2 hafta süreyle yerleştirin. Şişeleri bir sıvı azot tankının buhar fazına aktarın. Hücre kültürünü yeniden başlatmak için 37 ° C'de bir su banyosunda 1 adet dondurulmuş flakonu çözdürün. Bir 1,000-μL pipet kullanarak 15 mL'lik bir tüpteki 7 mL'lik önceden ısıtılmış eksiksiz NI ortamındaki hücreleri hafifçe toplayın. Hücreleri 130 x g'de 3 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı kaldırın ve 1000 μL'lik bir pipet kullanarak 1 mL'lik tam NI ortamında hücreleri nazikçe yeniden süspanse edin. Daha da iyisi, 3 veya 4 mL'lik komple NI ortamında hücre süspansiyonunu seyreltin ve tripan mavisi ve otomatik bir hücre sayıcısı (not: trypan mavisinin 20 μL'sinde hücre süspansiyonunun 20 μL'sini seyreltin, çözülmeden sonra canlılığı ≥ 80 olmalıdır %). Yaklaşık 50.000 hücre / cm2'lik bir yoğunluğa sahip NSC'leri kaplanmış bir 60 mm'lik Petri kabı (veya T25 şişesi) içine yerleştirin. 5. CharaHiPSC kaynaklı nöronal ve glial hücrelerin cterizasyonu NOT: Farklılaştıkça, nöronal ve glial türevleri, aşağıdaki bölümlerde açıklananlar gibi farklı teknikler kullanılarak karakterize edilebilir. Kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) analizleri 10 HiPSC koloni parçalarını, EB'leri ve / veya NSC'leri 130 xg'de 3 dakika döndürün. RNA ekstraksiyonu için uygun bir kitte sağlanan 100 μL soğuk RNA liziz tamponuna hücre topağını tekrar süspanse edin. Alternatif olarak, ortamı aspire ederek ve plakalarından nöronal / glial türevleri toplayın ve hücreleri toplamak için oyuklara soğuk RNA liziz tamponu ilave edin. RNA'yı üreticinin talimatlarını izleyerek izole edin. RNA'dan cDNA'ya yeniden transkripsiyona kadar uygun bir kit kullanılarak toplam RNA'nın 500 ng'ini ters transkribe edin. Uygun ana karışım ve primer kullanılarak qPCR reaksiyonlarını çift olarak çalıştırın( Malzeme Tablosuna bakınız ). Flüoresan emisyonunu gerçek zamanlı olarak kaydedin: 60 ° C'de tavlanmış primerlerle 45 devir. Göreceli RNA miktarlarını referans genler olarak GAPDH ve β-aktine göre normalleştirin ve kalibre edici koşullar için farklılaşmamış hiPSC'ler veya işlem görmemiş hücreler kullanın (ΔΔCt yöntemi). Alternatif olarak, başka uygun bir yöntem kullanın. İmmunositokimya ve yüksek içerikli görüntüleme (HCI) 6 , 11 Oda sıcaklığında 15 dakika süreyle hiPSC kolonileri, NSC'ler ve / veya nöronal / glial türevleri soğuk% 4 paraformaldehid ile fikse edin. 1X PBS'de yavaşça hücreleri yıkayın ve plakları 1 aya kadar 4 ° C'de saklayın. Boyama için hazır olduğunuzda, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca permeabilizasyon tamponu (% 0.1 triton-X-100 ve% 3 BSA içeren 1x DPBS) içindeki hücreleri permeabilize edin. Geçirgen hale getirme işlemini kaldırFfer ve antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için 15 dakika süreyle oda sıcaklığında hücreleri bloke edici tampon (% 3 BSA / 1X DPBS) içerisinde inkübe edin. Bloke edici tamponu çıkarın ve hücreleri gece boyunca 4 ° C'de uygun primer antikorları içeren bloke edici tampon içerisinde inkübe edin ( Malzeme Tablosuna bakın ). Hücreleri 3 kez 1x PBS ile yıkayın. Hücreleri, DAPI boya ile çekirdekleri karşıt boyama fluorochrome-konjuge ikinci antikorlar (Malzeme Tablosu'na bakın) içeren bloke edici tampon içinde oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Mümkünse uygun bir yüksek içerik görüntüleme platformu kullanarak ortalama floresan yoğunluğunu ve hücre tiplerinin göreceli yüzdesini ölçün ( Materyal Tablosuna bakın ). NOTLAR: Flüoresan arka planın yoğunluk seviyesini belirlemek için, bazı hücreleri / çukurları ikincil antikorlarla tek başına inkübe edin. Canlı (sabit değil) akış sitometrik analizi,SSEA4 gibi PSC'ye özel belirteçlerin ekspresyonunu değerlendirmek için ifferentifiye hiPSC'ler gerçekleştirilebilir (bkz . Malzeme Tablosu ). Farklılaşmamış hiPSC kolonileri alkalin fosfataz aktivitesi için üreticinin talimatlarını takip ederek piyasada bulunan BCIP / NBT kitleri kullanılarak analiz edilebilir (bkz . Malzeme Tablosu ). Ek olarak, Referans 12'de (test edilen antikorların bir listesi için, Malzeme Tablosuna bakınız) tarif edildiği gibi ters faz protein dizisi (RPPA) tahlilleri ve analizleri gerçekleştirilebilir . Elektrofizyolojik ölçümler 13 Tam ND ortamında (~ 1 x 105 hücre / tek oyuklu MEA çipi) kaplanmış çok elektrotlu dizilerde (MEA'lar; Malzemelerin Tablosuna bakınız ) ayrışmış rozet parçalarını (7 DIV'den sonra) veya rozetlerden türetilen NSC'leri plaklayın. Tam ND ortamında hücreleri 3 hafta boyunca tazeleyin, yenileyin.Haftada iki kez orta. Farklılaşmanın sonunda, kültürleri tekrarlanan ölçümler için steril tutmak için, laminer bir akış kapağının altında yarı geçirgen bir membran ile MEA cipsini kapatın. Kalan elektrotlardan kayıt yapılmasına olanak tanıyan elektrotlardan birini bir yer referansı ile değiştirin. 37 ° C ve% 5 CO 2'ye ayarlanmış entegre sıcaklık proses kontrolüne sahip bir MEA amplifikatörü kullanarak ortalama ateşleme oranını (MFR; sivri uçların / dakika sayısı) kaydedin. MEA ham verilerinden tepe noktalarını, -4.7σ eşik sınırı kullanarak algıla (σ, bazal gürültünün standart sapmasını gösterir). Kayıt sonrası verileri uygun bir yazılımla işleyin.