Ensaio para Medir o Transporte Nucleocitoplasmático em Tempo Real dentro de Células NSC-34 do tipo Motor-Neuron
Summary
Este protocolo descreve um método para medir sensivelmente a taxa de transporte nucleocitoplasmático dentro de células NSC-34 do tipo neurônio motor, quantificando a mudança em tempo real na importação nuclear de uma proteína NLS-NES-GFP.
Abstract
O transporte nucleocitoplasmático refere-se à importação e exportação de grandes moléculas do núcleo celular. Recentemente, vários estudos têm mostrado uma ligação entre a esclerose lateral amiotrófica (ELA) e deficiências na via nucleocitoplasmática. ALS é uma doença neurodegenerativa que afeta os neurônios motores e resultando em paralisia e, finalmente, na morte, em média 2-5 anos. A maioria dos casos de ELA são esporádicos, sem qualquer ligação genética aparente, mas 10% são herdados de forma dominante. Recentemente, as expans�s de repeti�o de hexanucle�idos (HREs) no gene 72 de leitura aberta do cromossoma 9 (C9orf72) foram identificadas como uma causa gen�ica de ALS e dem�cia frontotemporal (FTD). É importante notar que diferentes grupos propuseram recentemente que estes mutantes afectam o transporte nucleocitoplasmático. Esses estudos mostram principalmente o resultado final e manifestações causadas por HREs sobre o transporte nucleocitoplasmático, mas eles não demonstram disfunção de transporte nuclear emtempo real. Como resultado, apenas a deficiência grave de transporte nucleocitoplasmático pode ser determinada, principalmente devido à alta sobreexpressão ou inserção de proteína exógena.
Este protocolo descreve um ensaio novo e muito sensível para avaliar e quantificar a disfunção nucleocitoplasmática de transporte em tempo real. A taxa de importação de uma proteína NLS-NES-GFP (shuttle-GFP) pode ser quantificada em tempo real utilizando microscopia de fluorescência. Isto é realizado utilizando um inibidor de exportação, permitindo assim que a GFP de transporte apenas entre no núcleo. Para validar o ensaio, utilizaram-se as repetições de dipeptídeos traduzidos por HRE de C9orf72, poli (GR) e poli (PR), que anteriormente foram mostrados como perturbadores do transporte nucleocitoplasmático. Utilizando o ensaio descrito, observou-se uma diminuição de 50% na taxa de importação nuclear em comparação com o controlo. Usando este sistema, podem ser examinadas pequenas alterações no transporte nucleocitoplasmático e a capacidade de diferentes fatores para resgatar (mesmo parcialmente) um trato nucleocitoplasmáticoPode ser determinado.
Introduction
O complexo de poros nucleares (NPC) controla a importação e exportação de grandes moléculas dentro e fora do núcleo da célula. Em contraste com pequenas moléculas, que podem entrar no núcleo sem a regulação 1 , o transporte de moléculas maiores é fortemente controlado pelo NPC. Essas grandes moléculas, como proteínas e RNA, associam-se a fatores de transporte, incluindo importações e exportações, para serem importadas e exportadas do núcleo 2 . Para serem importados, as proteínas devem conter um pequeno motivo peptídico, geralmente chamado de sinal de localização nuclear (NLS), que é limitado por importinas 2 . Estas sequências de aminoácidos actuam como um marcador e são diversas na composição 3 , 4 . As proteínas podem ser exportadas do núcleo para o citoplasma devido à sua associação com aS, que ligam uma seqüência de sinal, geralmente chamada de sinal de exportação nuclear (NES) 2 . Ambos importins e exportins são capazes de transportar sua carga devido à regulação da pequena proteína nuclear relacionada Ras GTPase (Ran) 2 . Ran demonstrou-se que existem em diferentes estados conformacionais dependendo se está ligado a GTP ou GDP. Quando ligado a GTP, Ran pode vincular a importins ou exportins. Após a vinculação ao RanGTP, importins liberar sua carga, enquanto exportins deve vincular RanGTP para formar um complexo com sua carga de exportação. O estado de ligação de nucleótidos dominante de Ran depende da sua localização no núcleo (RanGTP) ou do citoplasma (RanGDP).
Recentemente, vários estudos têm demonstrado uma ligação entre deficiências na via nucleocitoplasmática e tanto a esclerose lateral amiotrófica (ELA) quanto a demência frontotemporal (FTD) 5 , 6 </sup7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . A ELA é uma doença neurodegenerativa progressiva e fatal que afeta os neurônios motores superiores e inferiores (MNs) 13 e resulta em paralisia e, em última instância, na morte, em média de 2 a 5 anos. A maioria dos casos de ELA é classificada como esporádica (SALS), sem qualquer ligação genética aparente, mas 10% são herdados de forma dominante (ALS familiar, FALS). Recentemente, foram identificadas as expans�s de repeti�o de hexanucle�idos (HREs) no gene 72 de leitura aberta do cromossoma 9 (C9orf72) 14 , 15 como uma causa gen�ica de ALS e FTD. Esses mutantes respondem por 30-40% dos casos FALS 16 , e diferentes estudos alegaramQue causam toxicidade por afetar o transporte nucleocitoplasmático 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 .
Estes estudos mostram principalmente os resultados finais e manifestações de HREs sobre o transporte nucleocytoplasmic, mas eles não demonstram disrupção nucleocytoplasmic em tempo real. Como resultado, apenas a deficiência grave de transporte nucleocitoplasmático foi avaliada 11 , 17 , 18 .
Este protocolo descreve um novo eSensível para avaliar e quantificar a disfunção nucleocitoplasmática de transporte em tempo real. A taxa de importação de uma proteína NLS-NES-GFP (shuttle-GFP) pode ser quantificada em tempo real utilizando microscopia de fluorescência. Isto é feito utilizando um inibidor de exportação, tal como descrito anteriormente 18 , permitindo assim que a vaivém-GFP apenas entre no núcleo. Usando a microscopia fluorescente e um software capaz de quantificar alterações fluorescentes em tempo real, é possível quantificar mudanças graduais na intensidade de fluorescência da nave-GFP, localizada no núcleo. Como resultado, pode ser feita uma curva de saturação tipo Michaelis-Menten do eixo de fluorescência ao tempo, representando a quantidade de GFP nuclear de transporte em qualquer momento dado. Usando a taxa linear inicial das curvas, é possível gerar uma inclinação, que representa a taxa de entrada no núcleo antes da saturação de fluorescência.
Para validar o ensaio, oForam utilizadas repetições de dipeptídeos C9orf72, poli (GR) e poli (PR), que foram previamente relatados como perturbadores do transporte nucleocitoplasmático, 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . Utilizando este ensaio, observou-se uma diminuição de 50% na taxa de importação nuclear em comparação com o controlo. Usando este sistema, podem ser examinadas pequenas alterações no transporte nucleocitoplasmático. Além disso, a capacidade de diferentes factores para resgatar um defeito de transporte nucleocitoplasmático pode ser determinada.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo demonstra um ensaio altamente sensível e quantitativo novo para avaliar mudanças minuciosas no transporte nucleocytoplasmic. Utilizando este sistema, é possível observar e medir o transporte nucleocitoplasmático e sua disfunção em tempo real, não só grandes defeitos que resultam em mudanças dramáticas na distribuição de proteínas. Este ensaio não só tem uma vantagem de sensibilidade, mas também requer pouca preparação, é barato e é um ensaio muito fácil e de baixo engajamento.
<p…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todos os membros do laboratório AI por seus comentários e sugestões úteis. Gostaríamos de agradecer ao Prof. Mark Hipp (Instituto Max Planck de Bioquímica) por nos fornecer o vetor shuttle-GFP. Este trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação de Ciência Israelense (ISF # 124/14), a Fundação de Ciência Binacional (BSF # 2013325), FP7 Marie Curie Carreira Integração Grant (CIG # 333794), eo Instituto Nacional de Psicobiologia em Israel NIPI # b133-14 / 15).
Materials
| Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34) | tebu-bio | CLU140-A |
| DMEM 4.5g/L L-glucose | Biological Industries | 01-055-1A |
| FBS European Grade | Biological Industries | 04-007-1A |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 |
| Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3111 |
| Cover glass 12mm dia. thick 0.13-0.17mm | Bar Naor LTD | |
| TurboFect Transfection Reagent | Thermo Scientific | R0531 |
| Axiovert 100 inverted microscope | Zeiss | |
| IMAGING WORKBENCH 2 | Axon Instruments | |
| Leptomycin B | Sigma | L2913 |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A |
| Homogenizer motor/control/chuck/90-degree clamp | Glas-Col | 099C K5424CE |
| MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002455 |
References
- Alberts, B. . Molecular biology of the cell. , (2002).
- Freitas, N., Cunha, C. Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins. Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).
- Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. A short amino acid sequence able to specify nuclear location. Cell. 39, 499-509 (1984).
- la Cour, T., et al. Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals. Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).
- Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Sci Rep. 6, 20877 (2016).
- Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 129-133 (2015).
- Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).
- Kwon, I., et al. Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells. Science. 345, 1139-1145 (2014).
- Rossi, S., et al. Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS. J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).
- Shi, K. Y., et al. Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
- Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 56-61 (2015).
- Zhang, Y. J., et al. C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins. Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).
- Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).
- DeJesus-Hernandez, M., et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron. 72, 245-256 (2011).
- Renton, A. E., et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron. 72, 257-268 (2011).
- Boeve, B. F., et al. Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72. Brain. 135, 765-783 (2012).
- Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).
- Woerner, A. C., et al. Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA. Science. 351, 173-176 (2016).
- Tao, Z., et al. Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity. Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).
- Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84, 1213-1225 (2014).
