Essai pour mesurer le transport des nucléocytoplasmes en temps réel dans les cellules NSC-34 de type Neuron moteur
Summary
Ce protocole décrit un procédé pour mesurer de façon sensible le taux de transport nucléocytoplasmique dans les cellules NSC-34 de type neurone moteur en quantifiant le changement en temps réel de l'importation nucléaire d'une protéine NLS-NES-GFP.
Abstract
Le transport des nucléocytoplasmes fait référence à l'importation et à l'exportation de grandes molécules à partir du noyau cellulaire. Récemment, un certain nombre d'études ont montré un lien entre la sclérose latérale amyotrophique (ALS) et les troubles de la voie nucléocytoplasmique. L'ALS est une maladie neurodégénérative affectant les neurones moteurs et entraînant une paralysie et, en fin de compte, la mort, en moyenne de 2 à 5 ans. La plupart des cas de SLA sont sporadiques, sans lien génétique apparent, mais 10% sont héréditaires de manière dominante. Récemment, les extensions de répétition d'hexanucléotide (HRE) dans le gène de lecture ouvert 72 du chromosome (C9orf72) ont été identifiées comme une cause génétique de la SLA et de la démence frontotemporelle (FTD). Il est important de noter que différents groupes ont récemment proposé que ces mutants affectent le transport nucléocytoplasmique. Ces études ont surtout montré le résultat final et les manifestations causées par les HRE sur le transport nucléocytoplasmique, mais ils ne démontrent pas le dysfonctionnement du transport nucléaire danstemps réél. En conséquence, seule une carence sévère en transport nucléocytoplasmique peut être déterminée, principalement en raison d'une surexpression élevée ou d'une insertion de protéines exogènes.
Ce protocole décrit un test nouveau et très sensible pour évaluer et quantifier le dysfonctionnement du transport nucléocytoplasmique en temps réel. Le taux d'importation d'une protéine NLS-NES-GFP (navette-GFP) peut être quantifié en temps réel en utilisant une microscopie fluorescente. Ceci est effectué en utilisant un inhibiteur d'exportation, ce qui permet à la navette GFP d'entrer dans le noyau. Pour valider l'analyse, on a utilisé le C9orf72 HRE traduit des répétitions de dipeptides, des poly (GR) et des poly (PR), qui ont été précédemment révélés pour perturber le transport nucléocytoplasmique. En utilisant le dosage décrit, une diminution de 50% du taux d'importation nucléaire a été observée par rapport au témoin. En utilisant ce système, des changements mineurs dans le transport nucléocytoplasmique peuvent être examinés et la capacité de différents facteurs à sauver (même partiellement) un nucléocytoplasmiqueLe défaut de l'anxiété peut être déterminé.
Introduction
Le complexe de pores nucléaires (NPC) contrôle l'importation et l'exportation de grandes molécules dans et hors du noyau de la cellule. Contrairement aux petites molécules, qui peuvent entrer dans le noyau sans la régulation 1 , le transport de molécules plus grandes est fortement contrôlé par le PNJ. Ces grandes molécules, telles que les protéines et l'ARN, associent aux facteurs de transport, y compris les importations et les exportations, pour être importées et exportées du noyau 2 . Pour être importés, les protéines doivent contenir un petit motif peptidique, généralement appelé signal de localisation nucléaire (NLS), qui est lié par importins 2 . Ces séquences d'acides aminés agissent comme une étiquette et sont diverses dans la composition 3 , 4 . Les protéines peuvent être exportées du noyau vers le cytoplasme en raison de leur association avec les exportationsS, qui lient une séquence signal, généralement appelée signal d'exportation nucléaire (NES) 2 . Les importations et les exportines sont capables de transporter leur cargaison en raison de la régulation de la petite protéine nucléaire GTPase (Ran) 2 de Ras. Ran a été démontré qu'il existe dans différents états conformationnels selon qu'il est lié à GTP ou PIB. Lorsqu'il est lié à GTP, Ran peut se lier à importins ou exportins. Lors de la liaison avec RanGTP, les importations libèrent leur cargaison, tandis que les exportateurs doivent lier RanGTP pour former un complexe avec leur cargaison d'exportation. L'état de liaison nucléotidique dominant de Ran dépend de son emplacement dans le noyau (RanGTP) ou le cytoplasme (RanGDP).
Récemment, un certain nombre d'études ont montré un lien entre les déficiences de la voie nucléocytoplasmique et la sclérose latérale amyotrophique (ALS) et la démence frontotemporelle (FTD) 5 , 6 </sup> , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . La SLA est une maladie neurodégénérative progressive et mortelle qui affecte les neurones moteurs supérieur et inférieur (MN) 13 et entraîne une paralysie et, en fin de compte, la mort, en moyenne de 2 à 5 ans. La plupart des cas d'ALS sont classés comme sporadiques (SALS), sans lien génétique apparent, mais 10% sont héréditaires de manière dominante (SLA familiale, FALS). Récemment, les extensions de répétition de l'hexanucléotide (HRE) dans le chromosome 9 ouvrir le cadre de la vue 72 (C9orf72) ont été identifiées 14 , 15 comme une cause génétique de la SLA et de la FTD. Ces mutants représentent 30 à 40% des cas FALS 16 , et différentes études ont soutenuQu'ils provoquent une toxicité en affectant le transport nucléocitoplasmique 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 .
Ces études ont surtout montré les résultats finaux et les manifestations des HRE sur le transport nucléocytoplasmique, mais ils ne démontrent pas de perturbation nucléocytoplasmique en temps réel. En conséquence, seule une carence sévère en transport nucléocytoplasmique a été évaluée 11 , 17 , 18 .
Ce protocole décrit un nouveau et unPour évaluer et quantifier le dysfonctionnement du transport nucléocytoplasmique en temps réel. Le taux d'importation d'une protéine NLS-NES-GFP (navette-GFP) peut être quantifié en temps réel en utilisant une microscopie fluorescente. Cela se fait en utilisant un inhibiteur de l'exportation, comme décrit précédemment 18 , permettant ainsi à la navette-GFP d'entrer dans le noyau. En utilisant une microscopie fluorescente et un logiciel capable de quantifier les changements fluorescents en temps réel, il est possible de quantifier les changements progressifs dans l'intensité de fluorescence de la navette-GFP, située dans le noyau. En conséquence, une courbe de saturation de Michaelis-Menten de l'axe de fluorescence à temps, représentant la quantité de navette-GFP nucléaire à tout moment donné, peut être réalisée. En utilisant le taux linéaire initial des courbes, il est possible de générer une pente, ce qui représente la vitesse d'entrée dans le noyau avant la saturation en fluorescence.
Pour valider l'analyse, la traductionD C9orf72 répétitions dipeptidiques, poly (GR) et poly (PR), qui ont été précédemment signalés pour perturber le transport nucléocytoplasmique, ont été utilisés 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . En utilisant ce dosage, une diminution de 50% du taux d'importation nucléaire a été observée par rapport au contrôle. En utilisant ce système, des changements minima dans le transport nucléocytoplasmique peuvent être examinés. En outre, la capacité de différents facteurs pour sauver un défaut de transport nucléocytoplasmique peut être déterminée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole démontre un nouveau dosage hautement sensible et quantitatif pour évaluer les changements minima dans le transport des nucléocytoplasmes. En utilisant ce système, il est possible d'observer et de mesurer le transport nucléocytoplasmique et son dysfonctionnement en temps réel, non seulement de grands défauts qui entraînent des changements spectaculaires dans la distribution des protéines. Ce test a non seulement un avantage de sensibilité, mais il nécessite également peu de préparation, est …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions tous les membres du laboratoire d'AI pour leurs commentaires et suggestions utiles. Nous tenons à remercier le Professeur Mark Hipp (Institut Max Planck pour la biochimie) pour nous avoir fourni le vecteur Shuttle-GFP. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation scientifique israélienne (ISF n ° 124/14), de la Fondation binationale des sciences (BSF # 2013325), de la subvention d'insertion professionnelle Marie Curie du 7e PC (CIG n ° 333794) et de l'Institut national de psychobiologie en Israël ( NIPI # b133-14 / 15).
Materials
| Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34) | tebu-bio | CLU140-A |
| DMEM 4.5g/L L-glucose | Biological Industries | 01-055-1A |
| FBS European Grade | Biological Industries | 04-007-1A |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 |
| Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3111 |
| Cover glass 12mm dia. thick 0.13-0.17mm | Bar Naor LTD | |
| TurboFect Transfection Reagent | Thermo Scientific | R0531 |
| Axiovert 100 inverted microscope | Zeiss | |
| IMAGING WORKBENCH 2 | Axon Instruments | |
| Leptomycin B | Sigma | L2913 |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A |
| Homogenizer motor/control/chuck/90-degree clamp | Glas-Col | 099C K5424CE |
| MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002455 |
References
- Alberts, B. . Molecular biology of the cell. , (2002).
- Freitas, N., Cunha, C. Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins. Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).
- Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. A short amino acid sequence able to specify nuclear location. Cell. 39, 499-509 (1984).
- la Cour, T., et al. Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals. Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).
- Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Sci Rep. 6, 20877 (2016).
- Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 129-133 (2015).
- Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).
- Kwon, I., et al. Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells. Science. 345, 1139-1145 (2014).
- Rossi, S., et al. Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS. J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).
- Shi, K. Y., et al. Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
- Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 56-61 (2015).
- Zhang, Y. J., et al. C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins. Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).
- Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).
- DeJesus-Hernandez, M., et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron. 72, 245-256 (2011).
- Renton, A. E., et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron. 72, 257-268 (2011).
- Boeve, B. F., et al. Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72. Brain. 135, 765-783 (2012).
- Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).
- Woerner, A. C., et al. Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA. Science. 351, 173-176 (2016).
- Tao, Z., et al. Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity. Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).
- Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84, 1213-1225 (2014).
