Análises histológicas de lesão hepática alcoólica aguda em peixe-zebra

A doença hepática alcoólica (ALD), que é causada pelo consumo excessivo de álcool, é uma das principais causas de morbidade e mortalidade relacionadas ao álcool. Nos Estados Unidos, quase metade das mortes por doença hepática envolve álcool ¹ , e a ALD é responsável por quase 1 em cada 3 transplantes de fígado ² . ALD tem um amplo espectro. A esteatose, que se caracteriza pelo excesso de acumulação de lípidos nos hepatócitos, ocorre no estágio inicial de consumo excessivo de álcool e é reversível após a cessação do uso de álcool. Sob a influência de fatores genéticos e ambientais ea ingestão contínua de álcool, a esteatose hepática pode evoluir para hepatite alcoólica e, eventualmente, cirrose ³ . Estudos usando os modelos de ALD de roedores forneceram insights substanciais sobre a doença, mas eles têm limitações (revisado na referência ³ ). A alimentação oral de uma dieta com álcool só causa esteatose em roedores ^{4 , <}/ Sup> ⁵ . O desenvolvimento de inflamação e fibrose requer um segundo insulto ^{6 , 7} ou infusão intragástrica crônica, que é invasiva e tecnicamente desafiadora ^8,9 . O tele-peixe-zebra também desenvolve lesão hepática em resposta ao tratamento crônico e álcool agudo ^{10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15} . Em particular, o peixe-zebra larval representa um organismo modelo complementar atractivo no qual se estuda a lesão hepática alcoólica aguda ^{10 , 11 , 13 , 15} . O fígado zebrafish é funcional e produz enzimas-chave para o metabolismo de etanol por 4 dias(Dpf) 13,16,17. O etanol pode ser adicionado diretamente à água ea exposição a etanol a 2% por 24 h é suficiente para induzir esteatose hepática e respostas fibrogênicas em larvas de peixe-zebra 13,15.

Tem sido relatado que o tratamento com etanol a 2% durante 24 horas resultou numa concentração de etanol tecidual de 80 mM em larvas de peixe-zebra ¹³ . Outros demonstraram que as larvas toleram esta concentração e que os fenotipos do fígado observados nos animais tratados são específicos da exposição ao etanol ^{11 , 13 , 15 , 18} . No entanto, como 80 mM é quase letal em seres humanos ¹⁹ , é importante avaliar a histologia do fígado do zebrafish tratado com etanol e deteImportância fisiológica para os seres humanos.

O rápido desenvolvimento externo e translucência das larvas de peixe-zebra permitem caracterizar a ação do álcool no fígado em tempo real e em amostras fixas. A disponibilidade de linhas transgênicas fluorescentes específicas de células e os recentes avanços na microscopia confocal facilitam o estudo de como diferentes tipos de células hepáticas modificam sua morfologia e comportamento em resposta ao tratamento agudo com etanol 11,15. No entanto, a imagem confocal do peixe-zebra transgénico fluorescente não pode substituir completamente a coloração com Hematoxilina e Eosina (H & E) quando se estuda a histologia do fígado. A marcação de todos os tipos de células hepáticas ao mesmo tempo utilizando peixes-zebra transgênicos requer a geração de linhas transgênicas individuais, cada uma rotulando um tipo de célula hepática com um fluoróforo único. A introdução de diferentes fundos transgênicos no mesmo peixe requerG gerações múltiplas, o que é demorado e oneroso. É necessária uma imunofluorescência adicional para detectar os componentes da matriz extracelular. A coloração de H & E, por outro lado, rotula simultaneamente todos os tipos de células hepáticas e componentes de matriz extracelular, proporcionando assim uma visão geral do fígado ²⁰ . Além disso, revela prontamente várias características histopatológicas de doenças hepáticas, tais como morte de hepatócitos, esteatose e fibrose. Embora H & E é uma mancha de rotina na histologia do fígado de mamíferos, não é comumente usado na pesquisa de fígado zebrafish, eo protocolo é menos bem estabelecida.

Este trabalho descreve um protocolo para tratamento de etanol agudo em larvas de peixe-zebra e para as análises histológicas de seguimento com coloração de H & E. O protocolo de coloração de H & E pode ser usado em todos os estudos de desenvolvimento e função do fígado. Além disso, as seções de parafina podem ser usadas para imuno-histoquímica, bem como para outrasIns na patologia hepática, incluindo a mancha tricrômica, mancha reticulina, etc.