光シートベースの蛍光生活の顕微鏡または固定し、染色<em>モドキTribolium castaneum</em>胚

darklingのカブトムシ（ゴミムシダマシ科）の大ファミリーに属するコクヌストモドキTriboliumののcastaneumは 、農業と生命科学の中に長い歴史を持っており、果実はキイロショウジョウバエを飛ぶした後、第2最高の研究のモデル昆虫モデル生物です。最後の四十年の間に、それは、様々な理由のための胚の形態形成に、過去20年の間に、進化の発生生物学では、発生遺伝学における強力かつ人気のある昆虫のモデル生物になったと：

ショウジョウバエとモドキTribolium両方がHolometabolaに属しているが、約300万年前に^{1、2、3、4}分岐しました。 ショウジョウバエの胚発生は、一般に、高度に誘導されたとみなされているが、 モドキTriboliumは develのより祖先モードを示します昆虫種^{5、6、7、8、9}のかなり大きい割合で発見されるopment。その口器とアンテナは胚^{10、11、12、13、14、15}の間に既に出現すなわちまず、 モドキTriboliumは 、非インボリュートヘッドの開発を示します。第二に、 モドキTriboliumが短生殖発達の原理に従う、 すなわち、腹部のセグメントがgermband伸び^{16、17、18、19}の間に後部成長ゾーンから連続的に添加されます。第三に、 モドキTriboliumが開発し、後に劣化します2胚体外膜は唯一の腹側に胚をカバー羊膜、および完全に^20、21、22胚を包む漿膜を、 すなわち 。両方の膜は、非常に重要な形態形成²³と同様に、微生物^24、25、乾燥²⁶に対して保護的な役割を果たしています。第四に、胎生開発脚は幼虫のライフステージの間に完全に機能していると蛹変態^{27、28、29、30、31}時の大人の足のための原基としての役割を果たす。

それらの小さなサイズと控えめな要求に、研究室でモドキTriboliumの栽培は非常に簡単です。野生型の培養物（WT）株またはトランスジェニック系統は、典型的には約100~300成人から成り、フルグレイン小麦から成る増殖培地で3〜4センチ高い（約50g充填した1リットルのガラス瓶（フットプリント80センチメートル^2））内に維持することができます小麦粉は非アクティブ乾燥酵母を補いました。水の供給は不要です。これは、小規模または中規模の市販の昆虫インキュベーター内甲虫培養物の多数を維持するために小さな研究所を可能にします。 モドキTriboliumの後の発生段階（幼虫後約第四齢、蛹及び成虫）を容易にふるい分けすることにより成長培地から分離されます。同期胚は産卵中に短い期間の成人をインキュベートすることによって得られます。在庫管理は、典型的には22〜25°C（世代あたり約10週間）で行っている間に急速な発展のために、甲虫の培養物を、32°C（世代あたり約4週間）に保たれています。

最後の10年以内に、多くの標準テック新興モデル生物ブック³²にまとめたようhniquesは徐々に、 モドキTriboliumに適応され、最適化されています。非常に重要で、このような胚^33、幼虫^34、35または親^36、37 RNA干渉に基づく遺伝子ノックダウン、 のpiggyBac ^38、39又はミノス ⁴⁰トランスポザーゼシステムおよびCRISPR / Cas9ベースゲノムのいずれかと生殖細胞系変換などの高度な遺伝学的方法でありますエンジニアリング^41。また、 モドキTriboliumゲノムは^、42十年ほど前に配列決定されており、効率的かつゲノムワイドな同定及び遺伝子⁴⁴の系統的な分析を可能にするゲノムの第三ラウンドアセンブリ^43を解放^し 、中であります</sアップ>または他の遺伝的要素^45、46。また、他の4つの鞘翅目の種のゲノムは、比較遺伝的アプローチ^{47、48、49、50}のために用意されています。配列決定ゲノムとの関連では、二つの大規模な遺伝子分析は、挿入突然変異誘発画面^51、画面^52、53をノックダウン系統的RNA干渉ベースの遺伝子、すなわち 、実行されています。

広視野共焦点または光シートベース顕微鏡（LSFM）と蛍光ライブイメージングは、多次元コンテキスト（ 表1）に（ すなわち、形態形成）時間の関数としてモドキTriboliumの胚の形態を観察することができます。広視野と共焦点蛍光顕微鏡では、excitエーション発光光が同じ対物レンズを介して導かれます。両方のアプローチにおいて、試料全体がすべて記録された2次元平面のために照射されます。したがって、試料は、非常に高いエネルギーレベルに供されます。 LSFMにおいて、焦点面における唯一のフルオロフォアは、2枚の垂直に配置された対物レンズ（ 図1）を用いて照明および検出の分離に励起されます。単一平面照明顕微鏡（SPIM）とデジタル走査されたレーザ光のシートベースの蛍光顕微鏡（DSLM、 図2） – – LSFMは、二つのカノン実装で来て、従来のアプローチに比べていくつかの重要な利点を提供する：（I）固有の光学セクショニング能力（ii）は、良好な距離分解能、（iii）の光退色を強く減少したレベル、（IV）、非常に低い光毒性、（V）高い信号対雑音比、（VI）、比較的高い取得速度、（VII）イメージング複数の方向および（vi沿って低い開口数の照明対物レンズ^54、55、56の使用へII）より深い組織浸透。

LSFMはすでに正常ほぼ全胚の形態形成^57を文書化すると背側の閉鎖²³の先頭に胚体外膜の破裂の原則を分析するためモドキTriboliumに適用されています。一般的にモドキTriboliumコミュニティで昆虫科学のためLSFMの魅力を高めるために、それは標準的な操作手順を確立し、方法、プロトコルおよび顕微鏡は、使いやすさのとなりのレベルにリソースのプールを改善するために非常に重要です発生生物学研究所での標準的なツールを-use、および生物学的な質問は注目の的に滞在。

このプロトコルはモドキTriboliumの基礎から始まります</ em>の栽培、 すなわちメンテナンス、生殖および胚のコレクション。次に、2つの実験戦略が示されている：（I）カスタムメイドのトランスジェニック系統のライブイメージングおよび蛍光色素（ 表2）を用いて染色した固定された胚の（ii）のイメージング。その後、わずかに異なる目的を持つ3つの取り付け技術は、（ 図3および表3）について詳細に説明する：（I）アガロースカラム、（ii）のアガロース半球および（iii）新規クモの巣ホルダ。プロトコルは、LSFMとデータ取得手順を説明します。イメージングモダリティとキーの考慮事項が概説されています。最後に、胚の検索について説明すると、基本的なデータ処理のための提案が提供されます。代表的な結果で、よりライブイメージングデータを2つの新規カスタムメイドおよびグリアブルー^58個のトランスジェニック系が示されており、それぞれの撮像データセットをダウンロード可能なリソースとして提供されます。また、画像蛍光色素の様々な染色された固定胚のデータが提示されています。議論は、品質管理、ライブイメージングアプローチの現在の制限および他の種へのプロトコルの適応に焦点を当てています。

プロトコルは、試料室及び典型的には、直径を有する金属、プラスチックまたはガラス製の円筒状の要素である標準化された試料ホルダ^{54、59、60、}のための回転可能なクランプ機構が装備されている光シートベースの蛍光顕微鏡用に書かれていますミリの範囲です。プロトコルはまた、両方のカノン実装、 すなわち SPIMとDSLM、ならびに二つ以上の照明および検出腕^61、62、63とのセットアップのために適しています。代表的な結果は、2つのスペクトル・チャネルのデータを示し、緑色（IL488nmレーザー、50分の525バンドパスフィルタを介して検出）および561 nmレーザーと赤色（照明、70分の607バンドパスフィルタを介して検出）を有する部分の光量が、プロトコルは、3つのまたは4つのスペクトル・チャネルに拡張することができます。