Işık Levha tabanlı Floresan Yaşayanlar Mikroskopi veya Sabit ve Lekeli<em> Tribullum castaneum</em> Embriyolar

Kara böceklerin büyük bir aile (Tenebrio) aittir kırmızı un böceği Tribolium castaneum, tarım ve yaşam bilimleri içinde uzun bir geçmişi vardır ve meyve sonra ikinci en iyi çalışılan model, böcek model organizma Drosophila melanogaster sinek olduğunu. Son dört yılda, bu çeşitli nedenlerle için embriyonik morfojenezinde, son yirmi yılda, evrimsel gelişim biyolojisi, gelişimsel genetiği güçlü ve popüler böcek model organizma haline geldi ve:

Drosophila ve Tribolium hem Holometabola aittir ama yaklaşık 300 milyon yıl önce ^{1, 2, 3, 4} sapmıştır. Yüksek türetilen Drosophila embriyonik gelişim yaygın olarak kabul edilmekle birlikte, Tribolium devel bir Atalara modu gösterirböcek türlerine ^{5, 6, 7, 8, 9} dikkate değer bir oranda bulunan opment. Onun ağız ve antenler embriyogenez ^{10, 11, 12, 13, 14, 15} boyunca ortaya çıkmakta, yani ilk olarak, Tribolium olmayan involuted baş geliştirme sergiler. İkinci olarak, Tribolium kısa tohumu geliştirme, örneğin, karın segmentleri germband uzama ^{16, 17, 18, 19} boyunca, arka büyüme bölgesinden ilave edilirler ilkelerini izler. Üçüncüsü, Tribolium geliştirmekte ve daha sonraki alçaltıriki ekstra-embriyonik zarlarını çok ventral embriyo kapsar amniyon, ve tamamen ^{20, 21, 22} embriyo saran serozası, yani. Her iki membranlar çok önemli bir morfogenetik ²³ yanısıra mikroorganizmalar ^{24, 25} ve kuruması ²⁶ karşı koruyucu bir rol oynar. Dördüncü olarak, embriyonik gelişmekte bacaklar larva yaşam safhasında tamamen işlevsel ve pupa başkalaşım ^{27, 28, 29, 30, 31} boyunca, yetişkin bacaklar için primordia olarak görev yapar.

Nedeniyle kendi küçük boyutları ve mütevazı talepleri, laboratuvarda Tribolium ekimi oldukça basittir. yabanıl tip Kültürler (WT) suşları veya transgenik çizgiler, tipik olarak yaklaşık 100-300 yetişkin oluşur ve tam tahıl buğday oluşur büyüme ortamı ile üç ila dört santimetre yüksek (yaklaşık 50 gr doldurulmuş bir litrelik bir cam şişe (ayak 80 ^cm2)) içinde tutulabilir un aktif kuru maya ile takviye edilmiştir. Bir su kaynağı gerekli değildir. Bu küçük veya orta ölçekli ticari olarak bulunabilen böcek kuluçka içinde böcek kültürlerinin onlarca tutmak için hatta küçük laboratuvarlar sağlar. Tribolium Daha sonra gelişim evreleri (larvalar sonra yaklaşık dördüncü safha, pupa ve yetişkin) kolayca eleme ile büyüme ortamından ayrılır. Senkronize embriyolar yumurtlama ortamı üzerinde kısa bir süre için yetişkin inkübe edilmesi ile elde edilir. stok tutma tipik 22-25 ° C'de gerçekleştirilir iken hızla gelişmesi için, böcek kültürleri, 32 ° C (kuşak başına yaklaşık dört hafta) tutulur (yaklaşık on hafta nesil başına).

Son on yıl içinde, birçok standart tecGelişen model organizmalar kitap ³² özetlenen hniques yavaş yavaş uyarlanmış ve Tribolium için optimize edilmiştir. Büyük önem embriyonik ³³ gibi genetik yöntemler, larva ^{34, 35} ya da ebeveyn ^{36, 37} RNA interferans esaslı gen demonte ya piggyBac ^{38, 39} ya da Minos ⁴⁰ transposaz sistemi ve CRISPR / Cas9 tabanlı genomu ile tohum çizgisi dönüşüm ilerletilirler mühendislik ^41. Bundan başka, Tribolium genom on yıl önce ⁴² ile ilgili dizilenmiştir ve etkin ve genom kimlik ve genin ^44. sistematik analiz sağlar düzeneği ⁴³ serbest genomun üçüncü turda, şimdi </syukarı> ya da diğer genetik elemanlar ^{45, 46.} Buna ek olarak, diğer dört koleopteran türlerinin genomlarının karşılaştırmalı genetik yaklaşımlar ^{47, 48, 49, 50} mevcuttur. Sekanslanmış genom ile bağlantılı olarak, iki büyük ölçekli genetik analizler bir araya sokma mutajenez ekran ⁵¹ ve sistematik bir RNA girişimi esaslı gen demonte ekran ^{52, 53,} yani gerçekleştirilmiştir.

Geniş açılı, konfokal veya hafif levha bazlı mikroskobu (LSFM) ile floresan canlı görüntüleme çok boyutlu bir içerik (Tablo 1), zamanın bir fonksiyonu (örneğin, morfojenezi) halinde Tribolium embriyonik morfolojisi gözlemlenebilir. widefield ve konfokal floresan mikroskobu olarak, Excittirme ve emisyon ışık aynı objektif merceği içinden yönlendirilir. Her iki yaklaşımda da tüm numune her kaydedilen iki boyutlu düzlemde için aydınlatılmaktadır. Bu nedenle, numuneler çok yüksek enerji seviyesine tabi tutulmaktadır. LSFM olarak, odak düzlemi sadece flüoroforlar bağlı iki dikey yerleştirilmiş objektif lens (Şekil 1) kullanılarak aydınlatma ve saptama bir dekuplaj heyecan bulunmaktadır. Bir uçak ışıklandırma mikroskobu (SPIM) ve dijital taranmış lazer ışığı levha bazlı floresan mikroskobu (DSLM, Şekil 2) – – LSFM iki kanonik uygulamalarda gelir ve geleneksel yöntemlere göre birçok önemli avantajlar sunmaktadır: (i) iç optik kesit özelliği, (ii) iyi eksenel çözünürlüğü, (iii) foto-ağartma kuvvetli düşük bir seviyesi, (iv) çok düşük foto-toksisite, (v) yüksek sinyal-gürültü oranı, (vi), nispeten yüksek bir edinim hızı, (vii) görüntüleme birden fazla yönde ve (vi boyuncanedeniyle düşük sayısal açıklık aydınlatma objektifler ^{54, 55, 56} kullanımına ii) daha derin doku penetrasyonu.

LSFM zaten başarıyla neredeyse tüm embriyonik morfonogenezi ⁵⁷ belgelemek ve dorsal kapatma ²³ başında ekstra embriyonik membran rüptürü ilkelerini analiz etmek Tribolium içinde uygulanmıştır. Mikroskop bir kolaylığı olur nerede standart çalışma usulleri belirlemektir ve yöntemleri, protokolleri ve bir seviyeye kaynakların havuzu geliştirmek için büyük önem taşımaktadır, Tribolium toplumda ve genel olarak böcek bilimi için LSFM çekiciliğini artırmak için gelişimsel biyoloji laboratuvarlarında standart aracını -KULLANMA ve biyolojik sorular dikkat merkezinde kalmak.

Bu protokol Tribolium temelleri <ile başlar/ em> ekimi, yani bakım, üreme ve embriyo koleksiyonu. Daha sonra, iki deneysel stratejileri gösterilmiştir: (i) canlı ısmarlama transgenik hatların görüntüleme ve floresan boyalar (Tablo 2) ile boyanmıştır sabit embriyolar (ii) görüntüleme. (I) agaroz sütunu, (ii) agaroz hemisfer ve (iii) yeni örümcek ağı tutucu: Daha sonra, biraz daha farklı amaçlarla üç montaj teknikleri detaylı (Şekil 3 ve Tablo 3) açıklanmıştır. protokol daha sonra LSFM ile veri toplama işlemini açıklar. Görüntüleme Yöntemleri ve temel düşünceler özetlenmiştir. Son olarak, embriyo alma açıklanır ve temel veri işleme için öneriler ortaya konmuştur. Temsili sonuçlarda, canlı görüntü verileri iki yeni ısmarlama ve Glia mavisi ⁵⁸ transjenik çizgi gösterilir ve karşılık gelen görüntü veri kümeleri indirilebilir bir kaynak olarak temin edilmiştir. Ayrıca, görüntüFloresan boyalar, çeşitli ile boyandı sabit embriyoların veriler sunulmaktadır. tartışma kalite kontrol, canlı görüntüleme yaklaşımının geçerli sınırlamalar ve diğer türlere protokolünün adaptasyonu odaklanır.

Protokol, bir numune haznesi ve tipik olarak bir çapa sahip bir metal, plastik ya da camdan yapılmış silindir şekilli elemanlar olan standart numune tutucuları ^{54, 59, 60,} bir döner kelepçe mekanizması ile donatılmıştır ışık levha bazlı floresan mikroskobu için yazılmıştır milimetre aralığındadır. Protokol, her iki kanonik uygulamalarda örneğin, SPIM ve DSLM, aynı zamanda iki ya da daha fazla aydınlatma ve tespit kolları ^{61, 62, 63} ile kurulumları için uygundur. temsili sonuçlar, iki tayf kanalları verileri gösterir, yeşil (IL488 nm lazer, saptama bir geçiş filtresi bandpass 607/70 bir geçiş filtresi) ve kırmızı (bir 561 nm lazer ile aydınlatma, algılama bandpass 525/50), ancak protokol ile bir aydınlatma üç ya da dört spektral kanallara genişletilebilir.