Av tüfeği Proteomics derinlemesine Karakterizasyonu için LERLIC-MS / MS ve Glutamin ölçümü ve Asparajin deamidasyonu
Summary
Burada uzun uzunlukta elektrostatik itme-hidrofilik interaksiyon kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (LERLIC-MS / MS) yöntemi bir adım adım protokol mevcut. Bu av tüfeği proteomik tarafından glutamin ve asparajin deamidasyon izoformlarının ilk kez ölçümü ve karakterizasyonu için sağlayan bir roman yöntemdir.
Abstract
Protein deamidasyon Karakterizasyonu İnsan patoloji ve diğer biyokimyasal bağlamlarda bu protein dönüşüm sonrası modifikasyonu (PTM) rolü (ler) i ve potansiyeli deşifre zorunludur. Protein deamidasyon karakterizasyonu gerçekleştirmek için, yakın zamanda glutamin (Gln), ve asparajin (Asn) izoformu ayırabilen yeni bir uzun uzunlukta elektrostatik itme-hidrofilik interaksiyon kromatografisi-tandem kütle spektrometrisi (LERLIC-MS / MS) yöntemi geliştirdik son derece karmaşık biyolojik örnekler model bileşiklerinden deamidasyon ürünleri. LERLIC-MS / MS, bu nedenle, bir, Gln, deamidasyon izoform ayrılması ve ölçümü için, ilk tüfek proteomik stratejisi. Ayrıca burada açıklanan örnek işleme protokolü LERLIC-MS / MS ile karakterizasyonu sağlayan süksinimid ara stabilize olduğu, bir yenilik olarak, göstermektedir. Bu video makalede gösterildiği gibi LERLIC-MS / MS uygulanması halen bilinmeyen aydınlatmak için yardımcı olabilirProtein deamidasyon n moleküler diziler. Buna ek olarak, LERLIC-MS / MS belirgin biyolojik kökenden deamidasyonu kapsayan enzimatik reaksiyonların daha iyi anlaşılmasını sağlar.
Introduction
Deamidasyonu bir protein dönüşüm sonrası modifikasyonu asparagin (Asn) ve / veya glutamin (Gln) kalıntıları 1 modifikasyonu yoluyla protein omurgasına bir negatif yük getirmektedir (PTM) 'dir. 2: 1 oranında Asn kalıntısının etki ederken bu değişiklik, bir ortak 3 de izomerik ürünleri isoaspartic asit (IsoAsp) ve n -aspartic asit (Asp) oluşturur. Rağmen, bu oran tamir enzimi, L-isoaspartyl metiltransferaz (PIMT) 3, 4 müdahalesi ile değiştirilebilir. Benzer şekilde, Gln kalıntısının deamidasyon beklenen 1 de izomer gama-glutamik asit (γ-Glu) ve alfa-glutamik asit izoformu (α-Glu) oluşturur: 7 oranında 3, 5, bu oran aksiyonu ile kaydırılabilir her yerde enzim transglutaminaz 2 ve diğer transglütaminazlar da dahil olmak üzere transglütaminaz 1, ebeyin 6 hücre dışı veziküller ile ilişkili olarak nzyme yakın zamanda tespit edilmiş.
Deamidasyon kökeni (birkaç kronik de Gln transamidasyon ile ilgili detaylar ve Etkileri 3 bakınız önceki transglütaminazlar ve diğer enzimler, transamidasyon yoluyla arası / molekül içi çapraz bağlanma aracılık ettiği Gln kalıntıları özellikle yaygındır, kendiliğinden veya enzimatik olarak mevcut olabilir ve ölümcül insan hastalıkları). Bu nedenle, deamidasyon etkilenen moleküller 4, 7, 8, önemli bir yapı üzerinde yankı ve işlevi vardır ve 9 yaşlanma, hizmet olarak moleküler saat dahil olmak üzere çeşitli biyokimyasal sonuçları ışığında derinlemesine bir kimyasal karakterizasyonu 3 gerektiren bir PTM olan .
Asn kalıntılarına deamidasyonunun olmasına rağmen nispeten aşağıdan yukarı tüfek proteomik ile iyi karakterize edilmiş 1, 10, Gln kalıntısının deamidasyon yine elektron esaslı radikal parçalanma 11 model bileşimlerinin zor analizi ötesinde, uygun bir karakterizasyon yöntemi bulunmamaktadır. Son zamanlarda, tek bir analizde karmaşık biyolojik numunelerin ve model bileşiklerinden Gln ve Asn deamidasyon izoformlarının ayrılmasını sağlayan yeni bir tek boyutlu tüfek proteomik stratejisi (LERLIC-MS / MS) 3 geliştirdik. LERLIC-MS / MS, uzun uzunlukta (50 sm) elektrostatik itme-hidrofilik interaksiyon kromatografisi (ERLIC) modunda çalışan iyon değişim kolonu (lax) kullanılarak triptik sindirilmiş peptidlerin ayrılması göre ve tandem kütle spektrometrisi ile birleştirilir (LC MS / MS). Bu yeni analitik strateji karakterize ve nispeten insan beyin dokularında her deamide kalıntısının ölçüde ölçmek için kullanılmıştırf "> 3. Yine de burada özetlenen protokol ilgi biyokimyasal bağlamında protein deamidasyon özelliklerini incelemek amaçlanmıştır LERLIC-MS / MS video görüntüleme sağlayacaktır.
ETİK TABLOSU
Bu protokolün tüm işlemler Singapur Nanyang Teknoloji Üniversitesi kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmış ve kurumsal kurallarına uygun olarak yapılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu video yazıda LERLIC-MS / MS 3'ün bir adım adım protokol sunmak için bir yöntem derinlemesine karakterizasyonunun ve doğru bir şekilde, protein deamidasyonu ve bu protein modifikasyonu ilgili enzimatik işlemlerin kapsamını tespit etmek. LERLIC-MS / MS elektrostatik itme-hidrofilik interaksiyon kromatografisi (ERLIC) 27 ilkesi altında uzun bir uzunlukta (50 sm) lax kullanımına dayanmaktadır. Çalışmamızda 3'te gösterildi?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Singapur (NMRC-OF-IRG-0003-2016) ve NTU-NHG Araştırma Grant Yaşlanma Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi (: Bu çalışma kısmen Eğitim Singapur Bakanlığının (Grant ARC9 / 15 Tier 2) hibe ile desteklenmiştir Grant ARG / 14017). Biz nazik bu çalışma mümkün kılan ambalaj materyalleri sağlayan Dr. Andrew Alpert ve PolyLC ekibine şükranlarımızı ve en içten teşekkürlerimi ifade etmek istiyorum.
Materials
| PolyCAT 3µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm – 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10X (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
References
- Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation. J Biol Chem. 262 (2), 785-794 (1987).
- Serra, A., Gallart-Palau, X., Wei, J., Sze, S. K. Characterization of Glutamine Deamidation by Long-Length Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) in Shotgun Proteomics. Anal Chem. , (2016).
- Reissner, K. J., Aswad, D. W. Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals. Cell Mol Life Sci. 60 (7), 1281-1295 (2003).
- Capasso, S., Mazzarella, L., Sica, F., Zagari, A. First evidence of spontaneous deamidation of glutamine residue via cyclic imide to [small alpha]- and [gamma]-glutamic residue under physiological conditions. JChem Soc, Chem Commun. (23), 1667-1668 (1991).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Gender differences in white matter pathology and mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease with cerebrovascular disease. Mol Brain. 9, 27 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Temporal lobe proteins implicated in synaptic failure exhibit differential expression and deamidation in vascular dementia. Neurochem Int. 80, 87-98 (2015).
- Robinson, N. E., Robinson, A. B. Molecular clocks. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98 (3), 944-949 (2001).
- Hao, P., et al. Enhanced separation and characterization of deamidated peptides with RP-ERLIC-based multidimensional chromatography coupled with tandem mass spectrometry. J Proteome Res. 11 (3), 1804-1811 (2012).
- Li, X., Lin, C., O’Connor, P. B. Glutamine deamidation: differentiation of glutamic acid and gamma-glutamic acid in peptides by electron capture dissociation. Anal Chem. 82 (9), 3606-3615 (2010).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Serra, A., et al. Plasma proteome coverage is increased by unique peptide recovery from sodium deoxycholate precipitate. Anal Bioanal Chem. , 1-11 (2016).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Uncovering Neurodegenerative Protein Modifications via Proteomic Profiling. Int Rev Neurobiol. 121, 87-116 (2015).
- Liu, Y. D., van Enk, J. Z., Flynn, G. C. Human antibody Fc deamidation in vivo. Biologicals. 37 (5), 313-322 (2009).
- Serra, A., et al. Commercial processed soy-based food product contains glycated and glycoxidated lunasin proteoforms. Sci Rep. 6, 26106 (2016).
- Serra, A., et al. A high-throughput peptidomic strategy to decipher the molecular diversity of cyclic cysteine-rich peptides. Sci Rep. 6, 23005 (2016).
- Leo, G., et al. Deamidation at asparagine and glutamine as a major modification upon deterioration/aging of proteinaceous binders in mural paintings. Anal Chem. 83 (6), 2056-2064 (2011).
- Wilson, J., van Doorn, N. L., Collins, M. J. Assessing the extent of bone degradation using glutamine deamidation in collagen. Anal Chem. 84 (21), 9041-9048 (2012).
- Buszewski, B., Noga, S. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)–a powerful separation technique. Anal Bioanal Chem. 402 (1), 231-247 (2012).
- Alpert, A. J., Hudecz, O., Mechtler, K. Anion-exchange chromatography of phosphopeptides: weak anion exchange versus strong anion exchange and anion-exchange chromatography versus electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Anal Chem. 87 (9), 4704-4711 (2015).
- Adav, S. S., et al. Dementia-linked amyloidosis is associated with brain protein deamidation as revealed by proteomic profiling of human brain tissues. Mol Brain. 9 (1), 20 (2016).
- Golde, T. E., Borchelt, D. R., Giasson, B. I., Lewis, J. Thinking laterally about neurodegenerative proteinopathies. J Clin Invest. 123 (5), 1847-1855 (2013).
- Gallart-Palau, X., Ng, C. H., Ribera, J., Sze, S. K., Lim, K. L. Drosophila expressing human SOD1 successfully recapitulates mitochondrial phenotypic features of familial amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 624, 47-52 (2016).
- Ouellette, D., Chumsae, C., Clabbers, A., Radziejewski, C., Correia, I. Comparison of the in vitro and in vivo stability of a succinimide intermediate observed on a therapeutic IgG1 molecule. mAbs. 5 (3), 432-444 (2013).
- Kumar, S., et al. Unexpected functional implication of a stable succinimide in the structural stability of Methanocaldococcus jannaschii glutaminase. Nat Commun. 7, 12798 (2016).
- Alpert, A. J. Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides. Anal Chem. 80 (1), 62-76 (2008).
- Hao, P., Ren, Y., Alpert, A. J., Sze, S. K. Detection, Evaluation and Minimization of Nonenzymatic Deamidation in Proteomic Sample Preparation. Mol Cell Proteomics. 10 (10), 111 (2011).
- Hao, P., Ren, Y., Datta, A., Tam, J. P., Sze, S. K. Evaluation of the effect of trypsin digestion buffers on artificial deamidation. J Proteome Res. 14 (2), 1308-1314 (2015).
- Liu, S., Moulton, K. R., Auclair, J. R., Zhou, Z. S. Mildly acidic conditions eliminate deamidation artifact during proteolysis: digestion with endoprotease Glu-C at pH 4.5. Amino Acids. 48 (4), 1059-1067 (2016).
