Mesure de la liaison des protéines à la F-actine par co-sédimentation

1. Préparer les matériaux Purifier la protéine d'intérêt (voir la section 2). Préparez ou achetez G-acttin. NOTE: La G-actine peut être isolée de plusieurs sources 1 ; En variante, il peut être acheté. La G-actine reconstituée (dans du Tris 5 mM pH 8,0, du CaCl2 0,2 ​​mM, de l'ATP 0,2 mM (triphosphate d'adénosine) et du dithiothréitol 0,5 mM (DTT)) doit être congelée, stockée à -80 ° C et> 10 mg / mL En portions aliquotes petites (10-20 μL), et décongelées juste avant leur utilisation. Les portions aliquotes de G-actine ne doivent pas être refrobriées. Préparez ou achetez une protéine témoin, telle que la BSA (voir étape 4.4). Préparez 10x de tampon de polymérisation (200 mM d'imidazole à pH 7,0, 1 M de KCl, 20 mM de MgCl2, 5 mM d'ATP et 10 mM d'EGTA (ethylene glycol-bis (β-aminoethyl ether) -N, N, N ', N'- Acide tétracétique)). Faire un stock 10x et ajuster le pH après l'ajout d'ATP, si nécessaire. Une aliquote (25 μL est un volume utile) et stockez à -80 et #176; C. Préparer 10 fois le tampon de réaction (200 mM d'imidazole à pH 7,0, 1,5 M de NaCl, 20 mM de MgCl2, 5 mM d'ATP et 10 mM d'EGTA). Faire un stock 10x et ajuster le pH après l'ajout d'ATP, si nécessaire. Une aliquote (50-100 μL est un volume utile) et stocker à -80 ° C. REMARQUE: la composition du tampon de réaction est souple et peut être nécessaire d'ajuster pour réduire la sédimentation de fond, limiter la liaison non spécifique et / ou améliorer la liaison (étapes 1.5.1-1.5.3). Ajuster le pH du tampon de réaction entre 6 et 8 pour optimiser la stabilité de la protéine. A un pH inférieur ou supérieur, remplacer un tampon approprié pour l'imidazole. REMARQUE: Utiliser pH 7.0 comme point de départ, sauf si une protéine nécessite un pH inférieur ou supérieur à la stabilité. Ne pas utiliser un tampon avec un pH inférieur à 6,0 ou supérieur à 8,0, car cela peut perturber l'actine. Les tampons recommandés (concentration finale et pH optimal indiqués) comprennent: MOPS 20 mM (acide 3 ( N -morpholino) propanesulfonique), pH= 6,5; 20 mM d'imidazole, pH = 7,0; HEPES 10 mM (acide 4- (2-hydroxyéthyl) pipérazine-1-éthanesulfonique), pH = 7,5; Et Tris 20 mM, pH = 8,0. Varier la concentration en sel du tampon de réaction, en fonction des besoins du dosage. NOTE: L'acétate est une protéine acide, et presque toutes les protéines liées à l'actine dépendent dans une certaine mesure des interactions électrostatiques associées à l'actine. Par conséquent, l'augmentation de la concentration en sel diminue la liaison de l'actine dans la plupart des cas. Le tampon de réaction utilise un niveau physiologique de sel (NaCl 150 mM, concentration de travail) et c'est le point de départ recommandé. Si nécessaire, la concentration en sel peut être abaissée ( par exemple, à 100 mM) pour favoriser la liaison ou augmenter pour limiter la liaison. Ne modifiez pas les concentrations de MgCl 2 , ATP ou EGTA dans le tampon de réaction, à moins qu'il n'y ait une raison spécifique de le faire. 2. Préparez la protéine d'essai pour l'analyse PréparationUne protéine de haute pureté en utilisant une chromatographie liquide pour obtenir les meilleurs résultats 7 . NOTE: Si vous utilisez une protéine recombinante, des étiquettes de protéines de grande taille, telles que la glutathion-S-transférase (GST), doivent être éliminées par clivage de protease de la protéine cible, car elles peuvent interférer avec la liaison. La TPS provoque également l'homodimérisation des protéines de fusion, ce qui peut augmenter artificiellement l'affinité de la liaison de l'actine. Déterminer la concentration de protéine en mesurant l'absorbance à 280 nm. Diviser par le coefficient d'extinction; Le coefficient d'extinction peut être calculé à partir de la séquence protéique en utilisant une analyse de séquence ou des outils en ligne. En variante, déterminer la concentration de protéines en utilisant des méthodes Bradford ou BCA (acide bicinchoninique). NOTE: Pour les expériences initiales, 50-100 μL de protéine à 20-40 μM sont généralement suffisants. Cela permettra l'analyse de la liaison dans la faible gamme micromolaire, un point de départ utile pour la plupart des protéines liées à l'actine. Un quan plus grandEt, souvent, une plus grande concentration de protéines est nécessaire pour générer une courbe de liaison pour calculer l'affinité (voir la section 5). Juste avant l'utilisation, faites tourner la protéine (50 000 à 100 000 xg pendant 10 min à 4 ° C) pour éliminer les agrégats de protéines insolubles. Si la solubilité est préoccupante, réévaluer la concentration de protéines (étape 2.2) après centrifugation. 3. Préparez la F-actine Retirez une aliquote de G-actine du congélateur à -80 ° C et décongé-la rapidement. Ajouter le tampon de polymérisation 10x à l'actine G à une concentration finale de 1x. Assurez-vous que la concentration de G-actine dans un tampon de polymérisation 1x est d'au moins 10-20 μM, bien au-dessus de la concentration critique. Incuber pendant 1 h à température ambiante (RT) pour permettre à l'actine de polymériser. Après polymérisation, stocker la F-actine en solution à 4 ° C, où elle sera stable pendant quelques semaines. Avant d'utiliser le F-acttin à nouveau après le stockage, inversez doucementOu faites glisser le tube plusieurs fois pour s'assurer que toute l'actine est dissoute et uniformément répartie en solution. NOTE: (Facultatif) Ajouter la phalloidine pour obtenir un rapport molaire 1: 1 de G-actine: phalloidine. Incuber pendant 30 min à la RT pour permettre à la phalloidine de se lier à la F-actine. La phalloidine stabilise la F-actine et accomplit deux choses: (i) elle réduit la quantité d'actine qui ne sédiment pas pendant la centrifugation et (ii) elle permet de diluer la F-actine au-dessous de la concentration critique (~ 0,5 μM), ce qui est souvent Nécessaire en variant la quantité de F-actine pour générer une courbe de liaison (voir la section 5 pour mesurer l'affinité). 4. Essai de granulométrie – Protocole de base NOTE: Le protocole de base décrit dans la section 4 est utilisé pour déterminer si une co-sédimentation de protéines d'intérêt avec la F-actine. Une fois que la liaison à la F-actine est établie, l'affinité de cette interaction peut être mesurée selon le protocole décrit à la section 5. Préparer le tampon de réaction le jour de l'utilisation en diluant le stock 10x à 1x et ajouter le DTT à une concentration finale de 1 mM. REMARQUE: (Facultatif) Ajouter le polidocanol à une concentration de travail finale de 0,02% dans le tampon de réaction. Le polidocanol est un agent tensioactif qui réduit la liaison de fond non spécifique et aide à empêcher les protéines hydrophobes de coller au tube à ultracentrifugation. Diluer la protéine d'intérêt pour les concentrations souhaitées dans 1x tampon de réaction dans des tubes à ultracentrifugation. Gardez les volumes d'échantillon bas (40-60 μL) pour éviter d'utiliser de grandes quantités de protéines en utilisant des tubes à ultracentrifugation avec de petits volumes minimum ( par exemple , des tubes de 7 x 20 mm contenant 0,2 ml chacun). NOTE: Étant donné que de nombreuses protéines liées à l'actine ont une affinité pour la F-actine dans la gamme micromolaire, il est recommandé de tester une protéine d'intérêt à 2 et 10 μM. Si la liaison n'est pas observée à 10 μM, il est peu probable que la liaison soit observée à des concentrations plus élevées. Si laLa protéine ajoutée représente plus de 10 à 20% du volume de réaction final, il peut être nécessaire de dialyser la protéine dans le tampon de réaction avant d'effectuer l'expérience. Ajouter la F-actine à la concentration finale souhaitée. NOTE: 2 μM est une concentration utile pour les expériences initiales car elle est bien supérieure à la concentration critique, ce qui maintient l'actine à l'état filamenteux. Elle produira une pastille visible lorsqu'elle est analysée par SDS-PAGE (étape 4.10). Préparez les contrôles suivants dans les tubes à ultracentrifugation pour rendre l'analyse informative. Préparez les échantillons contenant la protéine d'intérêt sans F-actine. Assurez-vous que la concentration de protéines dans ces échantillons correspond à la concentration dans les échantillons "plus F-actine". NOTE: Ces échantillons détermineront la quantité de protéine qui est agrégée ou collée sur les côtés du tube ultracentrifugeuse en l'absence de F-actine. Préparer des échantillons témoins négatifsÀ la (ou les) même (s) concentration (s) similaire (s) utilisée (s) pour la protéine d'intérêt. Utilisez une protéine de contrôle qui ne se lie pas à la F-actine, avec et sans F-actine. NOTE: Ceci est un contrôle important car les protéines peuvent être "piégées" dans les filaments d'actine et les pastilles avec la F-actine, même si elles ne lient pas la F-actine. La quantité de piégeage peut varier en fonction de la source F-acttin, des conditions de tampon, etc. Ainsi, ce contrôle doit être inclus dans toutes les expériences. Idéalement, la protéine de contrôle devrait avoir un poids moléculaire similaire à la protéine d'intérêt ( par exemple , pour l'αE-caténine (~ 100 kDa), la BSA (66 kDa) est un contrôle approprié). Les normes de filtration sur gel disponibles dans le commerce constituent d'excellentes protéines témoins, car elles couvrent une gamme de tailles et ne contiennent pas d'agrégats. En option, préparer des échantillons de contrôle positif contenant une protéine qui se lie à la F-actine, avec et sans F-actine. Veillez à ce que la (les) concentration (s) soit similaire à celle de laE protéines d'intérêt. NOTE: Ce contrôle est utile car il démontre que les conditions expérimentales ( p. Ex., F-actine préparée, tampon de réaction et centrifugation) permettent la liaison de l'actine F. Étant donné que le dosage de granulation peut ne pas détecter les interactions faibles de la F-actine (voir la Discussion), il est recommandé que la protéine de liaison à l'actine connue ait une affinité modérée à faible pour la F-actine ( c'est-à-dire dans la faible gamme micromolaire ). Les protéines de liaison à la F-actine purifiées sont disponibles dans le commerce. Incuber tous les échantillons pendant 30 min à la RT. NOTE: Les temps d'incubation plus longs sont bons, en supposant que la protéine d'intérêt est stable, bien que probablement inutile. Si la protéine d'intérêt n'est pas stable à la RT, les échantillons peuvent être incubés à 4 ° C. Dans ce cas, des temps d'incubation plus long peuvent être nécessaires. Chargez les échantillons dans le rotor de la centrifugeuse. Positionner les tubes dans le rotor pour aider à remettre en suspension la pastille après centrifugation.Pour cela, marquez tous les tubes de centrifugation ( p. Ex., Avec un numéro d'échantillon) et placez tous les tubes dans le rotor dans la même position ( par exemple, le numéro est tourné vers l'extérieur). Centrifuger à 100 000 xg pendant 20 min à 4 ° C dans une ultracentrifugeuse. Après centrifugation, éliminer 3/4 du surnageant ( par exemple , 45 μL si le volume de départ était de 60 μL) de chaque tube et mélanger avec 1/3 de volume de tampon d'échantillon 4x (15 μL dans ce cas) dans un tube de microcentrifugeuse séparé. Retirez le surnageant restant avec une pointe de chargement de gel, en prenant soin de ne pas perturber la pastille (ce qui peut être visible en tant que tache vitreuse). REMARQUE: Il est important d'enlever le surnageant des tubes dès que possible après la fin de la centrifugation afin de limiter la séparation de la dissociation des protéines. En outre, ne pas laver le culot avec tampon de réaction pour la même raison. Ajouter 4/3 volumes de 1x échantillon de tampon à chaque pelleT ( par exemple , 80 μL si le volume de départ était de 60 μL). NOTE: Ceci rend la dilution identique à celle du surnageant (étape 4.8, 1/3 de volume de tampon d'échantillon 4x ont été ajoutés), permettant la comparaison directe entre les échantillons de pastilles et de surnageants et la détermination du pourcentage de protéines qui ont été granulés. Ajouter un tampon d'échantillon à tous les tubes et incuber pendant au moins 5 minutes à la température ambiante. Permettre à la pastille de s'asseoir dans le tampon échantillon pour améliorer la récupération de l'échantillon. Triturer l'échantillon 8 à 10 fois avec une pointe de pipette p200 pour remettre en suspension la pastille en lavant en continu la zone de pastille du tube. Rincez doucement la pointe de la pipette sur la pastille pendant la trituration pour aider à la remise en suspension. REMARQUE: Veillez à ne pas introduire d'air dans l'échantillon pendant la trituration, car cela entraînera une explosion du tampon échantillon et réduira la récupération de l'échantillon. Transférer les échantillons remis en suspension à des tubes de microcentrifugation après la trituration. </ Ol> Analyser les échantillons de surnageant et de pastilles par SDS-PAGE et coloration de Coomassie 8 en chargeant 10-15 μl d'échantillon par voie; Ceci est suffisant pour visualiser les protéines. NOTE: Les protéines qui co-sédimentent avec la F-actine seront enrichies dans les échantillons de pastilles "plus F-actine" sur les échantillons de pastilles "non F-actine" ( Figure 1A ). La coloration bleue standard de Coomassie est suffisante pour la détection si les concentrations de protéines sont comprises entre 0,1 et 10 μM. Colloidal Coomassie 9 ou Western blot peut être utilisé pour augmenter la sensibilité si des concentrations de protéines inférieures sont utilisées pour mesurer des interactions d'affinité supérieure. Image des gels colorés au Coomassie à l'aide d'un scanner ou d'un système d'imagerie (étape 5.12). 5. Essai de granulation – Quantification Remarque: Si une liaison spécifique à la F-actine est observée, il peut être utile de mesurer l'affinité de tL'interaction. Ceci est réalisé en apportant quelques modifications et ajouts au protocole décrit dans la section 4. Pour un excellent guide pour la conception et l'interprétation des tests de liaison, voir Pollard 10 . Un organigramme ( Figure 2 ) est fourni pour l'aide à l'analyse et à la quantification. Déterminer la plage de concentration à tester. NOTE: La plage de concentration dépend de la protéine et devrait s'étendre d'une concentration inférieure à Kd apparente ( p. Ex., 1 μM) à des concentrations suffisamment élevées pour saturer la liaison. Il est essentiel que la liaison atteigne la saturation dans plusieurs échantillons à l'extrémité supérieure de la plage de concentration pour générer une courbe de liaison précise ( figure 1C ). Comme noté ci-dessus, de nombreuses protéines liées à l'actine ont une affinité pour la F-actine dans la gamme micromolaire faible (1-5 μM). Pour une protéine avec un K d de 0,5 à 1 μM, une plage de concentration de départ utile serait de 0,1-10 μM. Essorage dur (étape 2.3) la protéine d'intérêt pour éliminer les agrégats. Diluer la protéine en série afin de créer une série de concentrations contenant 7 à 8 échantillons à 2 fois la concentration finale à tester. Par exemple, si la gamme à tester est de 0,1-8 μM, préparer les dilutions suivantes dans 1x tampon de réaction: 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 et 0,2 μM. REMARQUE: Comme mentionné à l'étape 4.2, si la protéine ajoutée représente plus de 10% à 20% de la première dilution (l'échantillon de 16 μM dans l'exemple ci-dessus), il peut être nécessaire de concentrer davantage la protéine ou de dialyse Protéine en 1x tampon de réaction. Assurez-vous de préparer suffisamment de chaque dilution pour les échantillons "plus F-actine" et "pas de F-actine". Préparer des échantillons (comme dans la section 4), en diluant la protéine d'intérêt pour les concentrations souhaitées dans 1x tampon de réaction dans des tubes à ultracentrifugation. Gardez les volumes d'échantillons bas (40-60 μL) pour éviter d'utiliser de grandes quantités de protéines en utilisant des ultracentTubes rifuges avec de petits volumes minimaux ( p. Ex. , Tubes de 7 x 20 mm qui contiennent 0,2 ml chacun). Ajouter la F-actine à la concentration finale souhaitée aux échantillons appropriés et augmenter le volume en utilisant un tampon de réaction 1x. Par exemple, pour des réactions de 50 μL en utilisant une actine F de 2 μM, assurez-vous que chaque échantillon a 25 μL de protéine 2x, 10 μl d'actine F 10 μM et 15 μL de 1x tampon de réaction. Inclure les échantillons témoins (étapes 4.4.2 et 4.4.3). REMARQUE: Pour les contrôles négatifs et positifs, utilisez une concentration dans la plage à tester (étape 5.1), idéalement près du milieu jusqu'à la fin de la gamme ( par exemple, 4 μM si la plage de concentration est de 0,1 à 10 μM). Incuber tous les échantillons pendant 30 min à la RT. Après 30 min, retirer 1/5 de chaque échantillon ( par exemple, 10 μL de la réaction de 50 μl) et mélanger avec 20 μL d'eau et 10 μL de tampon échantillon 4x. REMARQUE: Ce sont les "Total" sAmples et sera utilisé pour générer une courbe standard. Chargez les échantillons dans le rotor de l'ultracentrifugeuse. Centrifuger pendant 20 min à 100 000 xg et 4 ° C. En option, après centrifugation, enlever 3/4 du surnageant ( par ex., 30 μL si le volume centrifugé était de 40 μL) de chaque tube et mélanger avec un tampon d'échantillon 4x (10 μL dans ce cas) dans un tube de microcentre séparé. Enlevez le surnageant restant avec une pointe de chargement de gel, en prenant soin de ne pas gêner la pastille. REMARQUE: Lors de la mesure de l'affinité de liaison, il n'est pas nécessaire d'exécuter le surnageant. Néanmoins, il peut être utile de sauvegarder le surnageant, surtout lorsqu'il teste une nouvelle protéine. Enlevez le surnageant si vous ne l'analysez pas (étape 5.7). Remettre en suspension la pastille dans 1 volume de tampon d'échantillon 1x ( par exemple, 40 μL si le volume centrifugé était de 40 μL). Ajouter un tampon d'échantillon à tous les tubes et incuber pendant au moins 5 minutes à la température ambiante. TrIturate l'échantillon 8-10 fois avec une pointe de pipette p200, en lavant continuellement la zone de pastille du tube. Rincez doucement la pointe de la pipette sur la pastille pendant la trituration pour aider à la remise en suspension. Transférer la protéine remis en suspension à un tube de microcentrifugeuse. REMARQUE: Ce sont les échantillons "Pellet". Analyser les échantillons Total et Pellet par SDS-PAGE 8 . Effectuez tous les échantillons sur un gel si possible; Sinon, exécuter les échantillons de pastilles sur un gel et les échantillons totaux sur une seconde. NOTE: Compte tenu du nombre d'échantillons, un grand système de gel est recommandé pour l'analyse. Si vous exécutez des échantillons sur deux gels ou plus, il est important que tous les gels soient colorés de manière identique ( c'est-à-dire la même solution de Coomassie et un temps identique en tache / décadence). Image Gels colorés au Coomassie à l'aide d'un système d'imagerie qui mesure les intensités de bande de protéines sur une large plage ( c'est-à-dire, deux à trois logs) et linéaire. Assurez-vous que les images aSont collectés sans pixels saturés. REMARQUE: les systèmes d'imagerie par laser offrent les meilleurs rapports de sensibilité et de signal sur bruit. En utilisant ImageJ ou un programme d'analyse similaire, mesure les intensités de bande de protéines et calcule la quantité de protéines liées. REMARQUE: pour toutes les mesures de l'échantillon, utilisez l'outil de sélection dans ImageJ pour dessiner une région d'intérêt (ROI) autour de chaque bande et mesurez (Analyser> Mesurer) la zone et la valeur grise moyenne. Calculez l'arrière-plan pour chaque gel en mesurant la valeur moyenne de gris d'une zone sans échantillon. Soustrayez la valeur de gris moyen de fond de chaque valeur de gris de ROI, puis multipliez par la zone pour obtenir la valeur de densité intégrée pour chaque bande. Mesurer la protéine des intensités de bande d'intérêt à partir des échantillons totaux ( figure 2A ). Générer une courbe standard en traçant l'intensité de la bande ( c.-à-d. Les mesures de densité intégrées) par rapport à la masse protéique ( Figure2B). Mesurer la quantité de protéines d'intérêt qui co-sédimenté avec la F-actine (protéine co-sédimentée, figure 2C ). Mesurez la quantité de protéines d'intérêt qui a sédimenté en l'absence de F-actine (sédimentation de fond, Figure 2D ). Soustraire la sédimentation de fond de la protéine co-sédimentée ( c. -à-d. Soustraire les valeurs de l'étape 5.13.4 de l'étape 5.13.3) pour déterminer la quantité de protéine liée à la F-actine. Mesurer la quantité de F-actine dans chaque pastille ( Figure 2E ). Déterminer la quantité moyenne de F-actine par échantillon, puis diviser chaque échantillon par la moyenne pour déterminer le rapport de F-actine dans chaque échantillon par rapport à la moyenne ( c.-à-d. Les nombres inférieurs aux bandes). Pour chaque échantillon, divisez la quantité de protéine liée (calculée à l'étape 5.13.5) par le taux de pastilles d'actine de F-actine (étape 5.13.6) pour ajuster les différences dans la pastille. NOTE: Cette valeur est la protéine liée normalisée. Utilisez la courbe standard (étape 5.13.2) pour calculer la quantité (masse) de la protéine liée normalisée (étape 5.13.7) dans chaque échantillon. REMARQUE: la protéine éliminée initialement (l'échantillon "total"), ainsi que la quantité chargée (qui, à moins que la pastille entière ne soit chargée, ne sera qu'une fraction de la pastille), doit être prise en compte lors du calcul de la quantité totale de protéine Qui a granulé. Déterminer la concentration de la protéine liée dans chaque échantillon de la masse totale de protéines dans la pastille (calculée à l'étape 5.13.8) et le volume de l'échantillon. Soustrayez cette valeur de la concentration de départ pour déterminer la quantité de protéines libres. Diviser la concentration de la protéine liée par la concentration d'actine (μM / μM d'actine) et par rapport à la concentration de protéines libres pour générer une courbe de liaison ( figure 1C ). NOTE: Étant donné que la F-actine n'est pas une espèce unique et uniforme, elle est diffiCulte d'extrapoler la concentration molaire de F-actine de la concentration de G-actine. Utiliser la concentration initiale de G-actine pour déterminer la quantité de protéine liée (μM / μM d'actine) et estimer la concentration apparente des sites de liaison dans la réaction. La concentration des sites de liaison est généralement inférieure à la concentration des monomères d'actine dans la réaction, car toutes les actines ne polymérisent pas et parce qu'une seule molécule de protéine de liaison d'actine peut entrer en contact avec de multiples monomères sur le filament d'actine. En utilisant un programme statistique, déterminez l'affinité (K d ) et B max de la courbe de liaison en utilisant une régression non linéaire des moindres carrés. REMARQUE: Les diagrammes de Scatchard sont découragés pour l'analyse des données de liaison, en partie parce qu'ils peuvent obscurcir si la liaison est saturée et parce qu'elles peuvent fausser l'erreur expérimentale 10 .