Medición de la unión de proteínas a actina F por co-sedimentación

1. Preparar los Materiales Purificar la proteína de interés (ver sección 2). Preparar o comprar G-actina. NOTA: La G-actina puede aislarse de múltiples fuentes 1 ; Alternativamente, se puede comprar. La G-actina reconstituida (en Tris 5 mM pH 8,0, CaCl2 0,2 ​​mM, ATP 0,2 mM (adenosina trifosfato) y ditiotreitol 0,5 mM (DTT)) se congeló de forma instantánea, se almacenó a -80ºC y geq 10 mg / ml En alícuotas pequeñas (10-20 μl), y se descongelan justo antes de su uso. Las alícuotas de G-actina no deben volver a congelarse. Preparar o comprar una proteína de control, como BSA (ver paso 4.4). Preparar un tampón de polimerización 10x (imidazol 200 mM a pH 7,0, KCl 1 M, MgCl2 20 mM, ATP 5 mM y EGTA 10 mM (éter de etilenglicol bis (β-aminoetil) -N, N, N ', N'- Tetraacético)). Hacer un stock 10x y ajustar el pH después de la adición de ATP, si es necesario. Alícuota (25 μL es un volumen útil) y almacenar a -80ºC & #176; C. Preparar 10x tampón de reacción (imidazol 200 mM pH 7,0, NaCl 1,5 M, MgCl2 20 mM, ATP 5 mM y EGTA 10 mM). Hacer un stock 10x y ajustar el pH después de la adición de ATP, si es necesario. Alícuota (50-100 μL es un volumen útil) y almacenar a -80 ° C. NOTA: La composición del tampón de reacción es flexible y puede ser necesario ajustarla para reducir la sedimentación de fondo, limitar la unión no específica y / o mejorar la unión (pasos 1.5.1 – 1.5.3). Ajustar el pH del tampón de reacción entre 6 y 8 para optimizar la estabilidad de la proteína. A un pH inferior o superior, sustituir el imidazol por un tampón apropiado. NOTA: Utilice pH 7.0 como punto de partida, a menos que una proteína requiera un pH menor o mayor para la estabilidad. No utilice un tampón con un pH inferior a 6,0 o superior a 8,0, ya que esto puede interrumpir la actina. Los tampones recomendados (concentración final y pH óptimo listados) incluyen: MOPS 20 mM (ácido 3- ( N- morfolino) propanosulfónico), pH= 6,5; 20 mM de imidazol, pH = 7,0; HEPES 10 mM (ácido 4- (2 – hidroxietil) piperazina – 1 – etanosulfónico), pH = 7,5; Y Tris 20 mM, pH = 8,0. Varíe la concentración de sal del tampón de reacción, dependiendo de las necesidades del ensayo. NOTA: La actina es una proteína ácida, y casi todas las proteínas de unión a actina dependen en cierta medida de las interacciones electrostáticas para asociarse con la actina. Por lo tanto, el aumento de la concentración de sal disminuye la unión de actina en la mayoría de los casos. El tampón de reacción utiliza un nivel fisiológico de sal (NaCl 150 mM, concentración de trabajo), y este es el punto de partida recomendado. Si es necesario, la concentración de sal puede reducirse ( por ejemplo, hasta 100 mM) para promover la unión o aumentada para limitar la unión. No cambie las concentraciones de MgCl 2 , ATP o EGTA en el tampón de reacción a menos que haya una razón específica para hacerlo. 2. Preparar la proteína de prueba para el ensayo PrepararEa proteína de alta pureza mediante cromatografía líquida para obtener los mejores resultados 7 . NOTA: Si se usa proteína recombinante, las etiquetas de proteínas grandes, tales como la glutatión-S-transferasa (GST) deben eliminarse por escisión de proteasa de la proteína diana, ya que pueden interferir con la unión. GST también provoca la homodimerización de proteínas de fusión, que puede aumentar artificialmente la afinidad de la unión de actina. Determine la concentración de proteína midiendo la absorbancia a 280 nm. Dividir por el coeficiente de extinción; El coeficiente de extinción se puede calcular a partir de la secuencia de proteínas usando análisis de secuencias o herramientas en línea. Alternativamente, determine la concentración de proteína usando métodos de Bradford o BCA (ácido bicinconínico). NOTA: Para los experimentos iniciales, generalmente son suficientes 50-100 μl de proteína a 20-40 μM. Esto permitirá el análisis de la unión en el rango micromolar bajo, un punto de partida útil para la mayoría de proteínas de unión a actina. Un quan más grandeY muchas veces se necesita una mayor concentración de proteína para generar una curva de unión para calcular la afinidad (véase la sección 5). Justo antes del uso, centrifugación fuerte de la proteína (50.000-100.000 xg durante 10 min a 4 ° C) para eliminar los agregados de proteína insoluble. Si la solubilidad es un problema, vuelva a medir la concentración de proteína (paso 2.2) después de la centrifugación. 3. Prepare la F-actina Retire una alícuota de G-actina del congelador de -80 ° C y descongelar rápidamente. Añadir el tampón de polimerización 10x a la G-actina hasta una concentración final de 1x. Asegúrese de que la concentración de G-actina en tampón de polimerización 1x es de al menos 10-20 μM, muy por encima de la concentración crítica. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente (RT) para permitir que la actina se polimerice. Después de la polimerización, almacenar la F-actina en solución a 4 ° C, donde será estable durante algunas semanas. Antes de usar la F-actina nuevamente después del almacenamiento, invierta suavementeO chasquear el tubo varias veces para asegurarse de que toda la actina se disuelva y se distribuya uniformemente en solución. NOTA: (Opcional) Añadir phalloidin para lograr una proporción molar de 1: 1 de G-actina: phalloidin. Incubar durante 30 min a RT para permitir que la faloidina se una a la F-actina. La phalloidin estabiliza la actina F y realiza dos cosas: (i) reduce la cantidad de actina que no sedimenta durante la centrifugación y (ii) permite diluir la actina F por debajo de la concentración crítica (~ 0,5 μM), lo que suele ser Necesaria para variar la cantidad de F-actina para generar una curva de unión (véase la sección 5 sobre la medición de la afinidad). 4. Ensayo de granulación – Protocolo Básico NOTA: El protocolo básico descrito en la sección 4 se utiliza para determinar si una proteína de interés co-sedimentos con F-actina. Una vez establecida la unión a F-actina, la afinidad de esta interacción puede medirse siguiendo el protocolo descrito en la sección 5. Preparar el tampón de reacción el día de uso diluyendo el stock 10x a 1x y añadir DTT a una concentración final de 1 mM. NOTA: (Opcional) Añada polidocanol a una concentración final de 0,02% en el tampón de reacción. El polidocanol es un surfactante que reduce la unión de fondo no específica y ayuda a evitar que las proteínas hidrófobas se peguen al tubo de ultracentrífuga. Diluir la proteína de interés a las concentraciones deseadas en tampón de reacción 1x en tubos de ultracentrífuga. Mantenga los volúmenes de muestra bajos (40-60 μL) para evitar el uso de grandes cantidades de proteína usando tubos de ultracentrífuga con pequeños volúmenes mínimos ( por ejemplo , tubos de 7 x 20 mm que contengan 0,2 ml cada uno). NOTA: Dado que muchas proteínas de unión a actina tienen una afinidad por la actina F en el intervalo micromolar, se recomienda ensayar una proteína de interés a 2 y 10 μM. Si no se observa unión a 10 μM, es poco probable que se observe unión a concentraciones más altas. Si elLa proteína añadida constituye más del 10-20% del volumen de reacción final, puede ser necesario dializar la proteína en el tampón de reacción antes de realizar el experimento. Añadir F-actina a la concentración final deseada. NOTA: 2 μM es una concentración útil para los experimentos iniciales porque está muy por encima de la concentración crítica, manteniendo así la actina en el estado filamentoso. Producirá un gránulo visible cuando se analiza mediante SDS-PAGE (etapa 4.10). Preparar los siguientes controles en tubos de ultracentrífuga para hacer el ensayo informativo. Preparar muestras que contengan la proteína de interés sin F-actina. Asegúrese de que la concentración de proteína en estas muestras coincida con la concentración en las muestras de "más F-actina". NOTA: Estas muestras determinarán la cantidad de proteína que se agrega o se pega a los lados del tubo de ultracentrífuga en ausencia de F-actina. Preparar muestras de control negativoA la misma concentración o concentraciones similares utilizadas para la proteína de interés. Utilice una proteína de control que no se una a F-actina, con y sin F-actina. NOTA: Este es un importante control porque las proteínas pueden quedar atrapadas en filamentos de actina y pellets con F-actina, aunque no se unan a la F-actina. La cantidad de atrapamiento puede variar dependiendo de la fuente de actina F, las condiciones del tampón, etc. De este modo, este control debe incluirse en todos los experimentos. Idealmente, la proteına de control deberıa tener un peso molecular similar a la proteına de interés ( por ejemplo , para αE-catenina (~ 100 kDa), BSA (66 kDa) es un control apropiado). Los estándares de filtración en gel comercialmente disponibles constituyen excelentes proteínas de control, ya que cubren una gama de tamaños y tienden a no contener agregados. Opcionalmente, preparar muestras de control positivo que contengan una proteína que se une a F-actina, con y sin F-actina. Asegúrese de que la (s) concentración (es) son similares a las deE proteína de interés. NOTA: Este control es útil porque demuestra que las condiciones experimentales ( p. Ej., F-actina preparada, tampón de reacción y centrifugación) permiten la unión de F-actina. Dado que el ensayo de granulación puede fallar en la detección de interacciones de F-actina débiles (véase la Discusión), se recomienda que la proteína de unión a actina F conocida tenga una afinidad moderada a débil por la actina F ( es decir, en el intervalo micromolar bajo ). Las proteínas purificadoras de unión a actina F están comercialmente disponibles. Incubar todas las muestras durante 30 min a RT. NOTA: Los tiempos de incubación más largos están bien, suponiendo que la proteína de interés es estable, aunque probablemente innecesaria. Si la proteína de interés no es estable a RT, entonces las muestras pueden incubarse a 4 ° C. En este caso, pueden ser necesarios tiempos de incubación más largos. Cargar las muestras en el rotor de la centrifugadora. Coloque los tubos dentro del rotor para ayudar a resuspender el gránulo después de la centrifugación.Para ello, marque todos los tubos de centrífuga ( por ejemplo, con un número de muestra) y coloque todos los tubos en el rotor en la misma posición ( por ejemplo, el número hacia fuera). Centrifugar a 100.000 xg durante 20 minutos a 4 ° C en una ultracentrífuga. Después de la centrifugación, retirar 3/4 del sobrenadante ( por ejemplo , 45 μl si el volumen de partida era 60 μl) de cada tubo y mezclar con 1/3 volúmenes de tampón de muestra 4x (15 μL en este caso) en un tubo de microcentrífuga separado. Quitar el sobrenadante restante con una punta de carga de gel, teniendo cuidado de no perturbar el gránulo (que puede ser visible como un punto vítreo). NOTA: Es importante eliminar el sobrenadante de los tubos tan pronto como sea posible después de la finalización de la centrifugación para limitar la disociación de proteínas después de la separación. Además, no lave el pellet con tampón de reacción por la misma razón. Añadir 4/3 volúmenes de 1x buffer de muestra a cada pelleT ( por ejemplo , 80 μl si el volumen de partida era 60 μl). NOTA: Esto hace que la dilución sea la misma que para el sobrenadante (paso 4.8, 1/3 de volúmenes de tampón de muestra 4x), permitiendo la comparación directa entre las muestras de pellets y sobrenadantes y la determinación del porcentaje de proteína que se sedimentó. Añadir tampón de muestra a todos los tubos e incubar durante al menos 5 min a RT. Permitir que el sedimento para sentarse en el buffer de muestra para mejorar la recuperación de la muestra. Triturar la muestra 8-10 veces con una punta de pipeta p200 para resuspender el gránulo lavando continuamente el área de gránulo del tubo. Raspe suavemente la punta de la pipeta sobre el pellet durante la trituración para ayudar con la resuspensión. NOTA: Tenga cuidado de evitar la introducción de aire en la muestra durante la trituración, ya que esto hará que el buffer de muestra burbujee y reducirá la recuperación de la muestra. Transferir las muestras resuspendidas a tubos de microcentrífuga después de la trituración. <Ol Analizar las muestras de sobrenadante y sedimento por SDS-PAGE y tinción 8 de Coomassie cargando 10-15 μl de muestra por carril; Esto es suficiente para visualizar las proteínas. NOTA: Las proteínas que co-sedimentan con F-actina se enriquecerán en las muestras de píldoras "más F-actina" sobre las muestras de pellet "sin F-actina" ( Figura 1A ). La tinción con azul de Coomassie estándar es suficiente para la detección si las concentraciones de proteína están en el intervalo de 0,1-10 μM. Coloidal Coomassie 9 o Western blot puede ser utilizado para aumentar la sensibilidad si se utilizan concentraciones de proteínas más bajas para medir las interacciones de mayor afinidad. Image Coomassie-geles manchados utilizando un escáner o sistema de imágenes (paso 5.12). 5. Ensayo de granulación – Cuantificación Nota: Si se observa la unión específica a F-actina, puede ser útil medir la afinidad de tInteracción. Esto se logra haciendo algunos cambios y adiciones al protocolo descrito en la sección 4. Para una guía excelente para diseñar e interpretar ensayos de unión, vea Pollard 10 . Un diagrama de flujo ( Figura 2 ) se proporciona para la ayuda con el análisis y la cuantificación. Determine el rango de concentración a probar. NOTA: El intervalo de concentración dependerá de la proteína y deberá extenderse desde una concentración por debajo de la Kd aparente ( por ejemplo, 1 μM) a concentraciones suficientemente altas para saturar la unión. Es crítico que la unión alcance la saturación en múltiples muestras en el extremo superior del intervalo de concentración para generar una curva de unión precisa ( Figura 1C ). Como se ha indicado anteriormente, muchas proteínas de unión a actina tienen afinidad por la actina F en el intervalo micromolar bajo (1-5 μM). Para una proteína con K $ _ { d} $ de 0,5-1 mu M, un intervalo útil de concentración inicial sería 0,1-10 mu M. Hard spin (etapa 2.3) la proteína de interés para eliminar los agregados. Serialmente diluir la proteína para hacer una serie de concentración que contiene 7-8 muestras a 2x la concentración final a ser probado. Por ejemplo, si el intervalo a ensayar es de 0,1 a 8 μM, se preparan las siguientes diluciones en tampón de reacción 1x: 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 y 0,2 μM. NOTA: Como se mencionó en el paso 4.2, si la proteína añadida constituye más del 10% -20% de la primera dilución (la muestra de 16 μM en el ejemplo anterior), puede ser necesario concentrar la proteína más lejos o dializar la De proteína en tampón de reacción 1x. Asegúrese de preparar suficiente cantidad de cada dilución para muestras "más F-actina" y "sin F-actina". Preparar las muestras (como en la sección 4), diluyendo la proteína de interés a las concentraciones deseadas en tampón de reacción 1x en tubos de ultracentrífuga. Mantenga los volúmenes de muestra bajos (40-60 μL) para evitar el uso de grandes cantidades de proteína mediante el uso de ultracentTubos de rifugas con pequeños volúmenes mínimos ( por ejemplo , tubos de 7 x 20 mm que contienen 0,2 ml cada uno). Añadir F-actina a la concentración final deseada a las muestras apropiadas y aumentar el volumen utilizando 1x buffer de reacción. Por ejemplo, para reacciones de 50 μl usando actina F 2 μM, asegúrese de que cada muestra tenga 25 μl de proteína 2x, 10 μl de actina F 10 μM y 15 μl de tampón de reacción 1x. Incluir muestras de control (pasos 4.4.2 y 4.4.3). NOTA: Para controles negativos y positivos, use una concentración dentro del rango a ser probado (paso 5.1), idealmente cerca del rango medio a alto del rango ( por ejemplo, 4 μM si el rango de concentración es 0.1-10 μM). Incubar todas las muestras durante 30 min a RT. Después de 30 min, retire 1/5 de cada muestra ( por ejemplo, 10 μL de la reacción de 50 μl) y mezcle con 20 μl de agua y 10 μl de tampón de muestra 4x. NOTA: Estos son los "Total" sY se utilizará para generar una curva estándar. Cargar las muestras en el rotor de la ultracentrífuga. Centrifugar durante 20 minutos a 100.000 xg y 4 ° C. Opcionalmente, después de la centrifugación, retirar 3/4 del sobrenadante ( por ejemplo, 30 μL si el volumen centrifugado es 40 μl) de cada tubo y mezclar con tampón de muestra 4x (10 μL en este caso) en un tubo de microcentrífuga separado. Retire el sobrenadante restante con una punta de carga de gel, teniendo cuidado de no alterar el gránulo. NOTA: Cuando se mide la afinidad de unión, no es necesario ejecutar el sobrenadante. No obstante, puede ser útil para salvar el sobrenadante, especialmente cuando se prueba una nueva proteína. Eliminar el sobrenadante si no se analiza (paso 5.7). Resuspender el gránulo en 1 volumen de 1x tampón de muestra ( por ejemplo, 40 μl si el volumen centrifugado era 40 μl). Añadir tampón de muestra a todos los tubos e incubar durante al menos 5 min a RT. TrIturate la muestra 8-10 veces con una extremidad de la pipeta de p200, lavando continuamente el área del gránulo del tubo. Raspe suavemente la punta de la pipeta sobre el pellet durante la trituración para ayudar con la resuspensión. Transferir la proteína resuspendida a un tubo de microcentrífuga. NOTA: Estas son las muestras "Pellet". Analizar las muestras de Total y Pellet mediante SDS-PAGE 8 . Ejecutar todas las muestras en un gel si es posible; Si no, ejecutar las muestras de pellets en un gel y el total de las muestras en un segundo. NOTA: Dado el número de muestras, se recomienda un sistema de gel grande para el análisis. Si se realizan muestras en dos o más geles, es importante que todos los geles estén teñidos de forma idéntica ( es decir, la misma solución de Coomassie y un tiempo idéntico en tinción / destain). Image Coomassie-geles manchados utilizando un sistema de imágenes que mide las intensidades de banda de proteínas en un amplio ( es decir, un dos a tres log) y rango lineal. Asegúrese de que las imágenesSe recogen sin píxeles saturados. NOTA: Los sistemas de imágenes basados ​​en láser ofrecen la mejor sensibilidad y relación señal / ruido. Utilizando ImageJ o un programa de análisis similar, mida las intensidades de la banda de proteínas y calcule la cantidad de proteína unida. NOTA: Para todas las mediciones de muestra, utilice la herramienta de selección en ImageJ para dibujar una región de interés (ROI) alrededor de cada banda y medir (área de medición) el área y el valor de gris medio. Calcular el fondo de cada gel midiendo el valor de gris medio de un área sin muestra. Restar el valor de gris medio de fondo de cada valor de gris medio ROI y luego multiplicar por el área para obtener el valor de densidad integrado para cada banda. Mida las intensidades de banda de proteína de interés de las muestras Total ( Figura 2A ). Generar una curva estándar trazando la intensidad de banda ( es decir, las mediciones de densidad integrada) versus masa de proteína ( Figura2B). Medir la cantidad de proteína de interés que co-sedimentado con F-actina (proteína co-sedimentada, Figura 2C ). Mida la cantidad de proteína de interés que sedimentó en ausencia de F-actina (sedimentación de fondo, Figura 2D ). Restar la sedimentación de fondo de la proteína co-sedimentada ( es decir, restar los valores de la etapa 5.13.4 de la etapa 5.13.3) para determinar la cantidad de proteína que se unen a F-actina. Mida la cantidad de F-actina en cada pellet ( Figura 2E ). Determine la cantidad promedio de actina F por muestra y luego divida cada muestra por el promedio para determinar la proporción de F-actina en cada muestra con relación al promedio ( es decir, los números por debajo de las bandas). Para cada muestra, divida la cantidad de proteína unida (calculada en el paso 5.13.5) por la proporción de píldoras de actina F actina (paso 5.13.6) para ajustar las diferencias en el gránulo. norteOTE: Este valor es la proteína unida normalizada. Utilice la curva estándar (paso 5.13.2) para calcular la cantidad (masa) de proteína unida normalizada (paso 5.13.7) en cada muestra. NOTA: La proteína eliminada inicialmente (la muestra "Total"), así como la cantidad cargada (que, a menos que se haya cargado el gránulo entero, será una fracción del gránulo), debe tenerse en cuenta al calcular la cantidad total de proteína Que sedimentaba. Determine la concentración de proteína unida en cada muestra de la masa total de proteína en el gránulo (calculada en el paso 5.13.8) y el volumen de la muestra. Restar este valor de la concentración inicial para determinar la cantidad de proteína libre. Se divide la concentración de proteína unida por la concentración de actina (μM / μM de actina) y la gráfica frente a la concentración de proteína libre para generar una curva de unión ( Figura 1C ). NOTA: Dado que la F-actina no es una especie única y uniforme es diffiCulto de extrapolar la concentración molar de F-actina de la concentración de actina G. Utilizar la concentración de G-actina inicial para determinar la cantidad de proteína unida (μM / μM de actina) y estimar la concentración aparente de sitios de unión en la reacción. La concentración de sitios de unión es usualmente menor que la concentración de monómeros de actina en la reacción porque no toda la actina se polimeriza y porque una sola molécula de proteína de unión a actina puede hacer contacto con múltiples monómeros sobre el filamento de actina. Utilizando un programa estadístico, determine la afinidad (K d ) y Bmax de la curva de unión usando la regresión no lineal de mínimos cuadrados. NOTA: Las parcelas de Scatchard se desalientan para analizar los datos de unión, en parte porque pueden oscurecer si la unión está saturada y porque pueden distorsionar el error experimental 10 .