Een niet-invasieve manier om te isoleren en fenotype cellen uit de conjunctiva
Summary
Het blootgestelde normale oculaire oppervlak bestaat uit hoornvlies en conjunctiva. Epitheliale cellen, spekcellen en immuuncellen zijn aanwezig in de conjunctiva. Hier wordt een niet-invasieve techniek van impressie cytologie beschreven met behulp van een impressie cytologie apparaat en flow cytometrie om immuuncellen in de conjunctiva te analyseren.
Abstract
Traditioneel wordt oculaire oppervlakte cytologie bestudeerd met technieken zoals spateltechnologie en kwasttechnologie. Het probleem met deze technieken is dat ze traumatische letsels op het oppervlak van het oog kunnen veroorzaken, wat kan leiden tot littekens, oogliddeformiteit, limale stamceldeficiëntie en in sommige gevallen een groot ongemak voor het onderwerp veroorzaken. Om deze klinische problemen te vermijden, werd de impressie cytologie (IC) ontwikkeld om de droge oogziekte en later neoplasia, atopische ziekte, vernal keratoconjunctivitis en keratoconjunctivitis sicca te diagnosticeren. Typisch snijden clinici filterpapieren handmatig in de vereiste vormen en toepassen ze op het oculaire oppervlak. Hier beschrijven we hoe u IC met behulp van een in de handel verkrijgbaar medisch apparaat uitvoert. Deze techniek wordt hier verklaard gevolgd door immunofenotyping door flowcytometrie. Deze techniek vereist minder handmatige hantering en veroorzaakt minder letsel op het oculaire oppervlak.
Introduction
Impressie-cytologie (IC) werd voor het eerst in 1977 uitgevoerd door Thatcher et al . Zij gebruikten een plastic indrukschijf om conjunctivale cellen van patiënten te verzamelen in plaats van andere technieken die op dat moment beschikbaar waren, zoals schrapen, zweven of pipetteren 1 . De huidige techniek van IC gebruikt een absorberend filterpapier 2 om de bulbar en palpebral conjunctiva af te drukken en de meest oppervlakkige laag conjunctivale cellen te verzamelen. Deze cellen, die hun eindfase van differentiatie hebben bereikt, worden continu in tranen gestort 3 . Drie belangrijke populaties van cellen worden gevonden in IC-specimens: epitheelcellen 4 , koppelcellen 3 , 5 en mucosale geassocieerd lymfoïdweefsel , met epithelium geassocieerde effector T-cellen of dendritische cellen 6 . Oculaire oppervlakte cellen in IC samPles kunnen worden geanalyseerd door microscopie, immuun-blotting en reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) 7 . Flowcytometrie is recentelijk gebruikt om immuuncellen te analyseren die zijn verzameld door het IC-membraan 8 te schrappen. Interessant is dat IC 6 , 9 gebruikt is om veel oculaire oppervlaktsiektes te evalueren, waaronder keratoconjunctivitis sicca, vitamine A-deficiëntie, cicatricial pemphigoid, atopische ziekte, superieure limbische keratoconjunctivitis, vernal keratoconjunctivitis en epitheliale plaveiselmetaplasia. IC is ook gebruikt voor het evalueren van de invloed van het dragen van contactlenzen, het detecteren van oculaire oppervlakmicrobes en het testen van therapeutische werkzaamheid en tolerantie van therapeutische interventies in longitudinale studies 10 , 11 , 12 .
Het medische apparaat (EyePrim) wordt ondersteund door een type polyEthersulfon (PES) 0,2 μm membraan, dat eerder is bekrachtigd voor de techniek van oculaire indrukcycologie met stromingscytometrie (OSIC-stroming) en opent mogelijkheden om longitudinale steekproeven te gebruiken om de ziekteprogressie te monitoren en respons op de behandeling ( bijvoorbeeld de gedetailleerde Analyse van intraepitheliale leukocyten gedefinieerd als vermeende ziekte markers voor progressieve conjunctiva fibrose in mucous membran pemphigoid) 13 . Vroege onderzoekers gebruikten geautoclaveerde PES-filters die handmatige indruk vereisen. Als gevolg hiervan was de opbrengst variabel en afhankelijk van de gebruiker. Het voordeel van dit medisch apparaat is het gebruiksgemak, de gestandaardiseerde druk (Pa of N / m 2 ), en maakt het mogelijk om herhaalbaarheid, reproduceerbaarheid en consistent cellulair herstel te herstellen. Deze techniek is handig in een buitenpatiënt kliniek omdat het niet-chirurgisch, makkelijk te presteren en snel is. Dit is een medisch apparaat van klasse I (steriel) volgens de richtlijn 93/42 / CEE, CE 0499 (SNCH). Het vereist alleenS actuele verdoving tijdens de procedure, die zorgt voor het behoud van de integriteit van het oculaire oppervlak. Na IC kunnen cellen onmiddellijk worden verwerkt voor flowcytometrie. Bovendien is het mogelijk dat technici en verpleegkundigen die niet in oogheelkunde zijn getraind om het oogoppervlak te proeven.
Ondanks de verbetering van IC over andere technieken, blijven er nog enkele uitdagingen. Bijvoorbeeld, er kan variatie zijn door het gebied van de steekproef en regionale verschillen in de bolletjes conjunctiva, afhankelijk van de positie van de IC. Een andere bron van variatie is te danken aan de toepassing van verschillende drukhoeveelheden tijdens IC. Andere methodologische problemen behelzen de standaardisatie van de celverwerking: deze omvatten duur en fixatiemethode en de omstandigheden van mogelijke opslag, die de stabiliteit van het bemonsterde materiaal kunnen beïnvloeden.
Het algemene doel van deze techniek is het ontwikkelen van een methode van isolatie van de oculaire indruk monsters thaT is makkelijk te gebruiken, niet invasieve en kan toegepast worden op de immunologische karakterisering van de klinische monsters.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit is een makkelijke, snelle en minder invasieve techniek die in de klinieken voor de patiënten kan worden gebruikt voor relatief snelle immuunprofielen in tegenstelling tot de conventionele technieken zoals schrapen, zweven, pipetten of absorberend filterpapier 1 , 2 . Een variant van deze techniek wordt al gebruikt in onderzoeksinstellingen 22 . De toekomstige toepassing van de voorgestelde methodologie is voor patiëntstratificatie in klinische studies met oogziekten, met name die welke immunofenotypen vereisen.
Een grote uitdaging met deze techniek is de relatief weinig immuuncellen die na het verzamelen van de indruk en het schrapen worden opgehaald. Het totale aantal CD3 + T-cellen die zijn hersteld van vier indrukken per individu, varieerde van ~ 500-1000 cellen. De oculaire monsters werden gewassen voor de flowcytometrie analyse voor een minimaal aantal keren om verder verlies van cel te vermijdens. Kritieke stappen en uitdagingen die binnen het protocol blijven, zijn een efficiënte collectie van oculaire monsters en het juiste schrapen van het membraan om hogere cijfers te bereiken. Desalniettemin is deze beperking onwaarschijnlijk te voorspellen tegen elk specifiek immuunfenotype. Het probleemoplossing dat hier is uitgevoerd om de opbrengst van cellen te maximaliseren was het aantal wasstappen na en vóór de incubatie van antilichamen te verminderen.
Er zijn andere beperkingen voor het gebruik van IC. Bij patiënten met ernstig keratiniseerd of fibrosed oculaire oppervlak, zoals in het Steven Johnson syndroom, kan de cellulaire opbrengst zelfs minder zijn dan die in deze studie. Het aandeel van immuuncellen kan veranderen als de monsters worden opgeslagen in plaats van op dezelfde dag geanalyseerd. Het is moeilijk om te voorspellen of bepaalde celtypes meer bestand zijn tegen opslag dan anderen. Vorige studies hebben gemeld verhoogde niveaus van HLA-DR expressie in de conjunctivale epitheelcellen 23 , dus het zou interEsting om de correlatie tussen HLA-DR en niveaus van specifieke immuuncellen te evalueren. Immuuncellen kunnen ook geassocieerd worden met het expressieniveau van chemokines. Deze problemen moeten in toekomstige studies worden aangepakt.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Nandini Nallappan en Sharon Yeo bedanken om te helpen met de technische stappen. De studie werd gefinancierd door een Start-Up Grant aan KGC van de Lee Kong Chian School of Medicine, de Nanyang Technologische Universiteit en door een Senior Clinician Scientist Award van het Nationaal Medisch Onderzoeksraad van Singapore van Singapore (NMRC) naar LT (NMRC / CSA / 045/2012) en door een subsidie van het NMRC en beheerd door het National Health Innovation Center aan KGC en LT (NHIC-12D-1409007).
Materials
| Reagents | |||
| anti-human CD3 BV510 | BD Biosciences | 563109 | |
| anti-human CD4 APCH7 | BD Biosciences | 641398 | |
| anti-human CD45RO PECy7 | BD Biosciences | 337168 | |
| 7-AAD solution | BD Biosciences | 555816 | |
| anti-human CCR7 PE | BD Biosciences | 552176 | |
| Pippetes | Eppendorf | NA | |
| Local Anaesthesia | Alcaine | NA | |
| Fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Keratograph 5M | Oculus | NA | |
| Slit lamp BioMicroscope | Haag Streit | BM900 | |
| EyePrim | Opia Technologies | NA | |
| FACS Verse | BD BioSciences | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| GraphPad 6.0 | Prism | NA | |
| FACSVerse analysis software | BD | NA |
References
- Thatcher, R. W., Darougar, S., Jones, B. R. Conjunctival impression cytology. Arch Ophthalmol. 95 (4), 678-681 (1977).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84 (6), 798-801 (1977).
- Baudouin, C. The pathology of dry eye. Surv Ophthalmol. 45, S211-S220 (2001).
- Nelson, J. D., Wright, J. C. Conjunctival goblet cell densities in ocular surface disease. Arch Ophthalmol. 102 (7), 1049-1051 (1984).
- Brignole, F., et al. Expression of Fas-Fas ligand antigens and apoptotic marker APO2.7 by the human conjunctival epithelium. Positive correlation with class II HLA DR expression in inflammatory ocular surface disorders. Exp Eye Res. 67 (6), 687-697 (1998).
- Knop, E., Knop, N. The role of eye-associated lymphoid tissue in corneal immune protection. J Anat. 206 (3), 271-285 (2005).
- Lopez-Miguel, A., Gutierrez-Gutierrez, S., Garcia-Vazquez, C., Enriquez-de-Salamanca, A. RNA Collection From Human Conjunctival Epithelial Cells Obtained With a New Device for Impression Cytology. Cornea. 36 (1), 59-63 (2017).
- Tomlins, P., Roy, P., Cunow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival impression for Flow Cytometry. Invest Opthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Barros Jde, N., Almeida, S. R., Lowen, M. S., Cunha, M. C., Gomes, J. A. Impression cytology in the evaluation of ocular surface tumors: review article. Arq Bras Oftalmol. 78 (2), 126-132 (2015).
- Calonge, M., et al. Impression cytology of the ocular surface: a review. Exp Eye Res. 78 (3), 457-472 (2004).
- Haller-Schober, E. M., et al. Evaluating an impression cytology grading system (IC score) in patients with dry eye syndrome. Eye (Lond). 20 (8), 927-933 (2006).
- Singh, R., Joseph, A., Umapathy, T., Tint, N. L., Dua, H. S. Impression cytology of the ocular surface. Br J Ophthalmol. 89 (12), 1655-1659 (2005).
- Williams, G. P., et al. Conjunctival Neutrophils Predict Progressive Scarring in Ocular Mucous Membrane Pemphigoid. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5457-5469 (2016).
- Best, N., Drury, L., Wolffsohn, J. S. Clinical evaluation of the Oculus Keratograph. Cont Lens Anterior Eye. 35 (4), 171-174 (2012).
- Downie, L. E., Keller, P. R., Vingrys, A. J. Assessing ocular bulbar redness: a comparison of methods. Ophthalmic Physiol Opt. 36 (2), 132-139 (2016).
- Amparo, F., Wang, H., Emami-Naeini, P., Karimian, P., Dana, R. The Ocular Redness Index: a novel automated method for measuring ocular injection. Investigative ophthalmology & visual science. 54 (7), 4821-4826 (2013).
- Shapiro, A., Merin, S. Schirmer test and break-up time of tear film in normal subjects. American journal of ophthalmology. 88 (4), 752-757 (1979).
- Finis, D., Pischel, N., Konig, C., Hayajneh, J., Borrelli, M., Schrader, S., Geerling, G. Comparison of the OSDI and SPEED questionnaires for the evaluation of dry eye disease in clinical routine. Ophthalmologe. 111 (11), 1050-1056 (2014).
- Behrens, A. Dysfunctional tear syndrome: a Delphi approach to treatment recommendations. Cornea. 25 (8), 900-907 (2006).
- Williams, G. P., Pachino, A., Long, H. M., Rauz, S., Curnow, S. J. Cytokine production and antigen recognition by human mucosal homing conjunctival effector memory CD8+ T cells. Invest Opthalmol Vis Sci. 55 (12), 8523-8530 (2014).
- Bose, T., Lee, R., Hou, A., Louis, T., Chandy, K. G. Tissue resident memory T cells in the human conjunctiva and immune signatures in human dry eye disease. Sci Rep. 7, 45312 (2017).
- Williams, G. P., et al. The dominant human conjunctival epithelial CD8alphabeta+ T cell population is maintained with age but the number of CD4+ T cells increases. Age (Dordr). 34 (6), 1517-1528 (2012).
- Mrugacz, M., Zak, J., Bakunowicz-Lazarczyk, A., Wysocka, J., Minarowska, A. Flow cytometric analysis of HLA-DR antigen in conjunctival epithelial cells of patients with cystic fibrosis. Eye (Lond). 21 (8), 1062-1066 (2007).
