Conjunktiva'dan Hücreleri İzole Etmek ve Fenotip Hedeflemek İçin İnvaziv Olmayan Bir Yöntem
Summary
Maruz kalan normal oküler yüzey kornea ve konjonktivadan oluşur. Konjunktiva içerisinde epitel hücreleri, goblet hücreleri ve immün hücreler bulunur. Burada, non-invaziv bir izlenim sitolojisi yöntemi, konjonktivadaki bağışıklık hücrelerini analiz etmek için bir impresyon sitolojisi cihazı ve akış sitometrisi kullanılarak tarif edilmiştir.
Abstract
Geleneksel olarak oküler yüzey sitolojisi, spatula teknolojisi ve fırça teknolojisi gibi teknikler ile incelenir. Bu tekniklerle ilgili problem, göz yüzeyinde travmatik lezyonlara neden olabilir; bunlar skarlasmaya, gözkapağı deformitesine, limbal kök hücre yetersizliğine kadar ilerleyebilir ve bazı durumlarda hastaya büyük rahatsızlık verirler. Bu klinik problemleri önlemek için kuru göz hastalığının ve daha sonra neoplazinin, atopik hastalığın, vernal keratokonjonktivitin ve keratokonjonktivit sicca'nın teşhisinde izlenim sitolojisi (IC) geliştirildi. Tipik olarak, klinisyenler elle filtre kağıdını istenilen şekillere kesip oküler yüzeyine uygularlar. Burada, piyasada satılan bir tıbbi cihaz kullanılarak IC'yi nasıl yürütüleceğini anlatacağız. Bu teknik burada flow sitometri ile imünofenotiplendirme ile izah edilmektedir. Bu teknik, daha az manuel elleçleme gerektirir ve göz yüzeyine daha az zarar verir.
Introduction
Etkileyici sitoloji (IC) ilk kez 1977'de Thatcher ve arkadaşları tarafından gerçekleştirildi . O sırada kazıma, sürünme veya pipetleme gibi diğer teknikler yerine konjonktival hücreleri toplamak için bir plastik izlenim diski kullandılar. Mevcut IC tekniği bulbarı ve palpebral konjunktivayı izole etmek ve konjunktival hücrelerin en yüzeysel katmanını toplamak için bir emici filtre kağıdı 2 kullanmaktadır. Farklılaşmanın nihai aşamasına ulaşan bu hücreler sürekli gözyaşı dökülür 3 . IC örneklerinde üç ana hücre popülasyonu bulunur: epitel hücreleri 4 , goblet hücreleri 3 , 5 ve mukozal ilişkili lenfoid doku, yani epitel ile ilişkili efektör T hücreleri veya dendritik hücreler 6 . IC sam'taki oküler yüzey hücreleriMikroskopi, bağışıklık lekelenmesi ve ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile analiz edilebilir 7 . Akım sitometri, son zamanlarda IC membran 8 kazınarak toplanan bağışıklık hücrelerini analiz etmek için kullanılmıştır. İlginç bir şekilde, IC 6 , 9 , keratokonjonktivitis sikka, vitamin A eksikliği, klinik antipsikoid, atopik hastalık, üstün limbik keratokonjonktivit, vernal keratokonjonktivit ve epitelyal skuamöz metaplazi de dahil olmak üzere birçok oküler yüzey hastalıklarını değerlendirmek için kullanılmıştır. IC, göz teması lenslerinin etkisini değerlendirmek, oküler yüzey mikroplarını tespit etmek ve longitudinal çalışmalarında terapötik etkinlik ve terapötik girişimlerin hoşgörüsünü test etmek için kullanılmıştır. 10 , 11 , 12 .
Tıbbi cihaz (EyePrim) bir çeşit poliAkış sitometrisi (OSIC-akışı) ile oküler impresyon sitolojisi tekniği için daha önce onaylanmış olan ve hastalığın progresyonunu ve tedaviye cevabı izlemek için uzunlamasına örneklemeyi kullanma fırsatlarını açan, 0.2 μm membran olan, eter-sülfon (PES) 0.2-μm membran Mukoza pemfigoidinde ilerleyici konjonktiva fibrozu için varsayılan hastalık markörleri olarak tanımlanan intraepitelyal lökositlerin analizi) 13 . Erken araştırmacılar, manuel izlenim gerektiren otoklavlanmış PES filtreleri kullandı. Sonuç olarak, verim değişkendir ve kullanıcı bağımlıdır. Bu tıbbi cihazın avantajı kullanım kolaylığı, standardize edilmiş basınç (Pa veya N / m 2 ) ve tekrarlanabilirlik, tekrarlanabilirlik ve tutarlı hücresel iyileşmeyi mümkün kılmaktadır. Bu teknik, cerrahi dışı, kolay uygulanabilen ve hızlı olduğu için, ayakta tedavi gören bir klinikte faydalıdır. Bu, 93/42 / CEE, CE 0499 (SNCH) direktifine göre Sınıf I (steril) tıbbi bir cihazdır. Sadece gerektirirGöz yüzeyinin bütünlüğünü sağlayan prosedür sırasında topikal anestezi uygulanması. IC'den sonra, hücreler akış sitometrisi için derhal işlenebilir. Ayrıca, oftalmoloji teknisyenleri ve hemşirelerinin göz yüzeyini örneklemek üzere eğitilmesi mümkündür.
IC'nin diğer tekniklerden daha iyi olmasına rağmen, birçok zorluk bulunmaktadır. Örneğin, örnekleme alanından ve bulbar konjunktivasındaki bölgesel farklardan dolayı IC'nin konumuna bağlı olarak değişiklik olabilir. Bir başka değişim kaynağı, IC sırasında farklı basınç miktarlarının uygulanmasından kaynaklanmaktadır. Diğer metodolojik konular hücre işlemesinin standartlaştırılmasını içerir: sabitleme süresi ve yöntemi ile örnek alınan malzemenin kararlılığını etkileyebilecek olası depolama şartları.
Bu tekniğin genel amacı, oküler izlenim örneklerinin izole edilmesi için bir yöntem geliştirmektir.T kullanımı kolaydır, invaziv değildir ve klinik örneklerin immünolojik karakterizasyonuna uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu, kazıma, sürünme, pipetleme veya emici filtre kağıdı 1 , 2 gibi geleneksel tekniklerle karşılaştırıldığında nispeten hızlı bağışıklık profillemesi için ayakta tedavi kliniklerinde kullanılabilen, kolay, hızlı ve daha az invaziv bir tekniktir. Bu tekniğin bir varyantı araştırma ayarları 22'de zaten kullanılmaktadır . Önerilen yöntemin ileride uygulanması, göz hastalıkları, özellikle immünofotasyon yapılması gereken klinik araştırmalardaki hasta sınıflandırması içindir.
Bu teknikle büyük bir sorun, izlenim toplama ve sıyırma işleminden sonra alınan nispeten az bağışıklık hücresidir. Kişi başına dört izlenimden elde edilen CD3 + T hücrelerinin toplam sayısı ~ 500 – 1,000 hücre arasında değişiyordu. Oküler numuneler, daha fazla hücre kaybını önlemek için akış sitometrisi analizinden önce en az sayıda yıkandıs. Protokol içerisinde kalan kritik adımlar ve zorluklar, göz numunelerinin etkin bir şekilde toplanması ve daha yüksek hücre sayıları elde etmek için zarın uygun şekilde kazınmasıdır. Bununla birlikte, bu kısıtlamanın herhangi bir bağışıklık fenotipine yönelmesi muhtemel değildir. Hücrelerin verimini en üst düzeye çıkarmak için burada yapılan sorun giderme, antikorların inkübasyonundan önce ve öncesinde yıkama adımlarının sayısını azaltmaktır.
IC'yi kullanmak için başka sınırlamalar da vardır. Steven Johnson sendromunda olduğu gibi ciddi keratinize veya fibroz oküler yüzeye sahip hastalarda, hücresel verim bu çalışmadaki verimden daha düşük olabilir. Örnekler aynı gün içinde analiz edilmek yerine saklanırsa bağışıklık hücrelerinin oranı değişebilir. Bazı hücre tiplerinin diğerlerine oranla depolamaya karşı daha dirençli olup olmadığını öngörmek zordur. Önceki çalışmalar, konjunktiva epitel hücrelerinde 23 yüksek HLA-DR ekspresyon seviyeleri bildirmiştir, bu nedenle inter-HLA-DR ve spesifik bağışıklık hücresi seviyeleri arasındaki korelasyonun değerlendirilmesi yönündeki düşünceler. Bağışıklık hücreleri aynı zamanda kemokinlerin ekspresyon seviyesiyle ilişkili olabilir. Bu konular gelecekteki çalışmalarla ele alınmalıdır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, teknik adımlarla yardım için Nandini Nallappan ve Sharon Yeo'ya teşekkür etmek istiyorlar. Çalışma, Lee Kong Chian Tıp Fakültesi, Nanyang Teknoloji Üniversitesi ve Singapur Sağlık Bakanlığı Ulusal Tıp Araştırma Konseyi (NMRC) tarafından LT'ye (NMRC / CSA / CSA) verilen Kıdemli Klinisyen Bilim İnsanı Ödülü ile KGC'ye bir Start-Up Grant tarafından finanse edildi. 045/2012) ve NMRC'den bir hibe ile Ulusal Sağlık Yenilik Merkezi tarafından KGC ve LT'ye (NHIC-12D-1409007) uygulanmıştır.
Materials
| Reagents | |||
| anti-human CD3 BV510 | BD Biosciences | 563109 | |
| anti-human CD4 APCH7 | BD Biosciences | 641398 | |
| anti-human CD45RO PECy7 | BD Biosciences | 337168 | |
| 7-AAD solution | BD Biosciences | 555816 | |
| anti-human CCR7 PE | BD Biosciences | 552176 | |
| Pippetes | Eppendorf | NA | |
| Local Anaesthesia | Alcaine | NA | |
| Fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Keratograph 5M | Oculus | NA | |
| Slit lamp BioMicroscope | Haag Streit | BM900 | |
| EyePrim | Opia Technologies | NA | |
| FACS Verse | BD BioSciences | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| GraphPad 6.0 | Prism | NA | |
| FACSVerse analysis software | BD | NA |
References
- Thatcher, R. W., Darougar, S., Jones, B. R. Conjunctival impression cytology. Arch Ophthalmol. 95 (4), 678-681 (1977).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84 (6), 798-801 (1977).
- Baudouin, C. The pathology of dry eye. Surv Ophthalmol. 45, S211-S220 (2001).
- Nelson, J. D., Wright, J. C. Conjunctival goblet cell densities in ocular surface disease. Arch Ophthalmol. 102 (7), 1049-1051 (1984).
- Brignole, F., et al. Expression of Fas-Fas ligand antigens and apoptotic marker APO2.7 by the human conjunctival epithelium. Positive correlation with class II HLA DR expression in inflammatory ocular surface disorders. Exp Eye Res. 67 (6), 687-697 (1998).
- Knop, E., Knop, N. The role of eye-associated lymphoid tissue in corneal immune protection. J Anat. 206 (3), 271-285 (2005).
- Lopez-Miguel, A., Gutierrez-Gutierrez, S., Garcia-Vazquez, C., Enriquez-de-Salamanca, A. RNA Collection From Human Conjunctival Epithelial Cells Obtained With a New Device for Impression Cytology. Cornea. 36 (1), 59-63 (2017).
- Tomlins, P., Roy, P., Cunow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival impression for Flow Cytometry. Invest Opthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Barros Jde, N., Almeida, S. R., Lowen, M. S., Cunha, M. C., Gomes, J. A. Impression cytology in the evaluation of ocular surface tumors: review article. Arq Bras Oftalmol. 78 (2), 126-132 (2015).
- Calonge, M., et al. Impression cytology of the ocular surface: a review. Exp Eye Res. 78 (3), 457-472 (2004).
- Haller-Schober, E. M., et al. Evaluating an impression cytology grading system (IC score) in patients with dry eye syndrome. Eye (Lond). 20 (8), 927-933 (2006).
- Singh, R., Joseph, A., Umapathy, T., Tint, N. L., Dua, H. S. Impression cytology of the ocular surface. Br J Ophthalmol. 89 (12), 1655-1659 (2005).
- Williams, G. P., et al. Conjunctival Neutrophils Predict Progressive Scarring in Ocular Mucous Membrane Pemphigoid. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5457-5469 (2016).
- Best, N., Drury, L., Wolffsohn, J. S. Clinical evaluation of the Oculus Keratograph. Cont Lens Anterior Eye. 35 (4), 171-174 (2012).
- Downie, L. E., Keller, P. R., Vingrys, A. J. Assessing ocular bulbar redness: a comparison of methods. Ophthalmic Physiol Opt. 36 (2), 132-139 (2016).
- Amparo, F., Wang, H., Emami-Naeini, P., Karimian, P., Dana, R. The Ocular Redness Index: a novel automated method for measuring ocular injection. Investigative ophthalmology & visual science. 54 (7), 4821-4826 (2013).
- Shapiro, A., Merin, S. Schirmer test and break-up time of tear film in normal subjects. American journal of ophthalmology. 88 (4), 752-757 (1979).
- Finis, D., Pischel, N., Konig, C., Hayajneh, J., Borrelli, M., Schrader, S., Geerling, G. Comparison of the OSDI and SPEED questionnaires for the evaluation of dry eye disease in clinical routine. Ophthalmologe. 111 (11), 1050-1056 (2014).
- Behrens, A. Dysfunctional tear syndrome: a Delphi approach to treatment recommendations. Cornea. 25 (8), 900-907 (2006).
- Williams, G. P., Pachino, A., Long, H. M., Rauz, S., Curnow, S. J. Cytokine production and antigen recognition by human mucosal homing conjunctival effector memory CD8+ T cells. Invest Opthalmol Vis Sci. 55 (12), 8523-8530 (2014).
- Bose, T., Lee, R., Hou, A., Louis, T., Chandy, K. G. Tissue resident memory T cells in the human conjunctiva and immune signatures in human dry eye disease. Sci Rep. 7, 45312 (2017).
- Williams, G. P., et al. The dominant human conjunctival epithelial CD8alphabeta+ T cell population is maintained with age but the number of CD4+ T cells increases. Age (Dordr). 34 (6), 1517-1528 (2012).
- Mrugacz, M., Zak, J., Bakunowicz-Lazarczyk, A., Wysocka, J., Minarowska, A. Flow cytometric analysis of HLA-DR antigen in conjunctival epithelial cells of patients with cystic fibrosis. Eye (Lond). 21 (8), 1062-1066 (2007).
