Uma maneira não invasiva de isolar e células de fenótipo da Conjuntiva
Summary
A superfície ocular normal exposta consiste em córnea e conjuntiva. As células epiteliais, as células caliciformes e as células imunes estão presentes na conjuntiva. Aqui, uma técnica não invasiva de citologia de impressão é descrita usando um dispositivo de citação de impressão e citometria de fluxo para analisar células imunes na conjuntiva.
Abstract
Tradicionalmente, a citologia de superfície ocular é estudada com técnicas como tecnologia de espátula e tecnologia de escova. O problema com estas técnicas é que eles podem induzir lesões traumáticas na superfície do olho, que podem progredir para cicatrizes, deformidades das pálpebras, deficiência de células estaminais e, em alguns casos, causar grande desconforto ao sujeito. Para evitar esses problemas clínicos, a citologia de impressão (IC) foi desenvolvida para diagnosticar doença ocular seca e posterior neoplasia, doença atópica, ceratoconjuntivite vernal e ceratoconjuntivite sicca. Normalmente, os clínicos cortaram manualmente os papéis de filtro em formas necessárias e aplicam-nas na superfície ocular. Aqui, descrevemos como realizar IC usando um dispositivo médico comercialmente disponível. Esta técnica é explicada aqui seguida pela imunofenotipagem por citometria de fluxo. Esta técnica requer menos manuseio manual e causa menor prejuízo para a superfície ocular.
Introduction
A citologia de impressão (IC) foi realizada pela primeira vez em 1977 por Thatcher et al . 1 . Eles usaram um disco de impressão plástica para coletar células conjuntivais de pacientes em vez de outras técnicas disponíveis naquela época, como raspagem, esfregaço ou pipetagem 1 . A técnica atual de IC usa um papel de filtro absorvente 2 para imprimir a conjuntiva bulbar e palpebral e coletar a camada mais superficial de células conjuntivais. Essas células, tendo alcançado seu estágio final de diferenciação, são continuamente lançadas em lágrimas 3 . Três grandes populações de células são encontradas em espécimes de IC: células epiteliais 4 , células de cálice 3 , 5 e tecido linfóide associado à mucosa, por exemplo, células T efectoras associadas ao epitélio ou células dendríticas 6 . Células de superfície ocular em IC samAs células podem ser analisadas por microscopia, imunocomposição e reação em cadeia da polimerase de transcriptase reversa (RT-PCR) 7 . A citometria de fluxo foi recentemente usada para analisar células imunes coletadas por raspagem da membrana IC 8 . Curiosamente, IC 6 , 9 tem sido usado para avaliar muitas doenças da superfície ocular, incluindo sicca de ceratoconjuntivite, deficiência de vitamina A, penfigóto cicatricial, doença atópica, ceratoconjuntivite limbica superior, ceratoconjuntivite vernal e metaplasia escamosa epitelial. O IC também tem sido utilizado para avaliar o impacto do uso de lentes de contato, a detecção de micróbios de superfície ocular e o teste de eficácia terapêutica e tolerância de intervenções terapêuticas em estudos longitudinais 10 , 11 , 12 .
O dispositivo médico (EyePrim) é suportado por um tipo de poliA membrana de ethersulfona (PES) de 0,2 μm, que foi previamente validada para a técnica de citologia de impressão ocular com citometria de fluxo (fluxo de OSIC) e abre oportunidades para usar amostras longitudinais para monitorar a progressão da doença e a resposta ao tratamento ( por exemplo , a detalhada Análise de leucócitos intraepiteliais definidos como marcadores de doença putativos para fibrose conjuntival progressiva em penfigóide de mucosas) 13 . Os primeiros pesquisadores usaram filtros de PES autoclavados que exigiam impressão manual. Como resultado, o rendimento era variável e dependente do usuário. A vantagem deste dispositivo médico é a facilidade de uso, a pressão padronizada (Pa ou N / m 2 ), e permite a repetibilidade, reprodutibilidade e recuperação celular constante. Esta técnica é útil em uma clínica ambulatorial porque não é cirúrgica, fácil de executar e rápida. Este é um dispositivo médico Classe I (estéril) de acordo com a diretiva 93/42 / CEE, CE 0499 (SNCH). Exige apenasS anestesia tópica durante o procedimento, o que garante a manutenção da integridade da superfície ocular. Após IC, as células podem ser processadas imediatamente para citometria de fluxo. Além disso, é possível que técnicos e enfermeiros que não sejam oftalmologistas sejam treinados para provar a superfície ocular.
Apesar da melhoria do IC sobre outras técnicas, ainda existem vários desafios. Por exemplo, pode haver variação devido à área da amostragem e diferenças regionais na conjuntiva bulbar dependendo da posição do IC. Outra fonte de variação é devido à aplicação de diferentes quantidades de pressão durante IC. Outras questões metodológicas envolvem a padronização do processamento celular: envolvem duração e método de fixação e as condições de armazenamento possível, o que pode afetar a estabilidade do material amostrado.
O objetivo geral desta técnica é desenvolver um método de isolamento das amostras de impressão ocular queT é fácil de usar, não invasivo e pode ser aplicado à caracterização imunológica das amostras clínicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esta é uma técnica fácil, rápida e menos invasiva que pode ser usada nas clínicas ambulatoriais para o perfil imune relativamente rápido, em contraste com as técnicas convencionais, como raspagem, esfregão, pipetagem ou papel filtrante absorvente 1 , 2 . Uma variante desta técnica já está sendo usada em configurações de pesquisa 22 . A aplicação futura da metodologia proposta é para a estratificação do paciente em ensaios clínicos com doenças oculares, especialmente aqueles que requerem imunofenotipagem.
Um grande desafio com esta técnica é o número relativamente pequeno de células imunes recuperadas após a coleta e raspagem de impressões. O número total de células T CD3 + recuperadas de quatro impressões por indivíduo variou de ~ 500 a 1000 células. As amostras oculares foram lavadas antes da análise de citometria de fluxo por um número mínimo de vezes para evitar uma perda adicional de célulasS. Os passos críticos e os desafios que permanecem dentro do protocolo são a coleta eficiente de amostras oculares e a raspagem adequada da membrana para atingir números celulares mais elevados. No entanto, é improvável que esta limitação se incline em direção a qualquer fenótipo imune específico. A solução de problemas realizada aqui para maximizar o rendimento das células foi reduzir o número de etapas de lavagem após e antes da incubação de anticorpos.
Existem outras limitações para o uso de IC. Em pacientes com superfície ocular gravemente queratinizada ou fibrosa, como na síndrome de Steven Johnson, o rendimento celular pode ser ainda menor que no presente estudo. A proporção de células imunes pode mudar se as amostras forem armazenadas em vez de analisadas no mesmo dia. É difícil prever se determinados tipos de células são mais resistentes ao armazenamento do que outros. Estudos anteriores relataram níveis elevados de expressão de HLA-DR nas células epiteliais conjuntivais 23 , por isso seria interPara avaliar a correlação entre HLA-DR e níveis de células imunes específicas. As células imunes também podem estar associadas ao nível de expressão das quimiocinas. Essas questões devem ser abordadas em estudos futuros.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a Nandini Nallappan e a Sharon Yeo por ajudar com as etapas técnicas. O estudo foi financiado por um Subsídio de Início para KGC da Escola de Medicina Lee Kong Chian, da Universidade Tecnológica de Nanyang e por um Prêmio de Cientista de Clínicos Sênior do Conselho Nacional de Pesquisa Médica do Ministério da Saúde de Singapura (NMRC) para LT (NMRC / CSA / 045/2012) e por uma doação do NMRC e administrado pelo Centro Nacional de Inovação da Saúde para KGC e LT (NHIC-12D-1409007).
Materials
| Reagents | |||
| anti-human CD3 BV510 | BD Biosciences | 563109 | |
| anti-human CD4 APCH7 | BD Biosciences | 641398 | |
| anti-human CD45RO PECy7 | BD Biosciences | 337168 | |
| 7-AAD solution | BD Biosciences | 555816 | |
| anti-human CCR7 PE | BD Biosciences | 552176 | |
| Pippetes | Eppendorf | NA | |
| Local Anaesthesia | Alcaine | NA | |
| Fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Keratograph 5M | Oculus | NA | |
| Slit lamp BioMicroscope | Haag Streit | BM900 | |
| EyePrim | Opia Technologies | NA | |
| FACS Verse | BD BioSciences | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| GraphPad 6.0 | Prism | NA | |
| FACSVerse analysis software | BD | NA |
References
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