דרך לא פולשנית לבודד תאים פנוטיפ מן הקונגרס
Summary
משטח העין הרגיל שנחשף מורכב קרנית ו הלחמית. תאי אפיתל, תאי גביע ותאי חיסון נמצאים בחניך. הנה, לא פולשנית, טכניקה של cytology הופעת מתואר באמצעות מכשיר cytology הרושם cytometry זרימה לנתח את תאי החיסון ב הלחמית.
Abstract
באופן מסורתי, cytology פני העין נלמד עם טכניקות כגון טכנולוגיית מרית ומברשת הטכנולוגיה. הבעיה עם טכניקות אלה היא שהם עלולים לגרום נגעים טראומטיים על פני העין, אשר יכול להתקדם הצטלקות, עיוות עפעף, חוסר תאי גזע limbal ובמקרים מסוימים, לגרום אי נוחות רבה לנושא. כדי למנוע בעיות קליניות אלו, פיתחה ציטולוגיה של הרושם (IC) לאבחון מחלות עיניים יבשות ומאוחר יותר נאופלזיה, מחלה אטופית, דלקת קרטוקונאנגיוויטיס ורידית וקרטוקו-גונקטיטיס סיקה. בדרך כלל, קלינאים לחתוך ידנית מסננים נייר לתוך צורות הנדרשים וליישם אלה על פני העין. כאן, אנו מתארים כיצד לבצע IC באמצעות מכשיר רפואי זמין מסחרית. טכניקה זו מוסברת כאן ואחריו immunophenotyping על ידי cytometry הזרימה. טכניקה זו דורשת טיפול ידני פחות גורם פחות פציעה על פני העין.
Introduction
Cytology ההופעה (IC) בוצעה לראשונה בשנת 1977 על ידי תאצ'ר ואח ' . הם השתמשו תקליטור פלסטיק כדי לאסוף תאים conjunctival מחולים במקום טכניקות אחרות הזמינות באותו זמן כגון גירוד, swabbing או pipetting 1 . הטכניקה הנוכחית של IC משתמשת נייר מסנן סופג 2 כדי להטביע את הנורה ואת הלחמית palpebral ולאסוף את השכבה השטחית ביותר של תאים conjunctival. תאים אלה, לאחר שהגיעו לשלב הסופי של ההבחנה שלהם, נשפכים ללא הרף בדמעות 3 . שלוש אוכלוסיות גדולות של תאים נמצאים דגימות IC: תאים אפיתל 4 , גביע תאים 3 , 5 , ואת רירית הלימפוזות הקשורים לימפויז דהינו אפיתל הקשורים המשפיע T תאים או תאים דנדריטים 6 . תאים פנימיים של העין ב- IC SamPles ניתן לנתח על ידי מיקרוסקופיה, חיסון סופג לאחור transcriptase פולימראז התגובה שרשרת (RT-PCR) 7 . זרימת cytometry שימש לאחרונה כדי לנתח תאים חיסוניים שנאספו על ידי שריטות קרום IC 8 . מעניין, IC 6 , 9 נעשה שימוש כדי להעריך הרבה מחלות פני השטח של העין כולל ceratoconjunctivitis sicca, מחסור בוויטמין A, pemphigoid cicatricial, מחלה atopic, מעולה keratoconctivivivivitis לימבית, דלקת קרטוקונאנגיוויטיס, ו metaplasia קשקשים אפיתל. IC שימש גם כדי להעריך את ההשפעה של עדשות מגע, גילוי חיידקי משטח העין, ובדיקת יעילות טיפולית וסובלנות של התערבויות טיפוליות במחקרים אורכיים 10 , 11 , 12 .
המכשיר הרפואי (EyePrim) נתמך על ידי סוג של פוליEthersulfone (PES) 0.2-מיקרומטר קרום, אשר כבר תוקף בעבר עבור הטכניקה של cytology ההופעה העין עם cytometry זרימה (זרימת OSIC) ופותח הזדמנויות להשתמש דגימה אורך כדי לפקח על התקדמות המחלה בתגובה לטיפול ( למשל , מפורט ניתוח של leukocytes intraepithelial שהוגדרו סמנים מחלה משוערת עבור פיברוזיג המפרק פרוגרסיבי ב פמפיגואיזם ממברנה רירית) 13 . חוקרים מוקדמים השתמשו במסנני PES אוטוקלאב הדורשים הופעה ידנית. כתוצאה מכך, התשואה הייתה משתנה ותלויית המשתמש. היתרון של מכשיר רפואי זה הוא קלות שימוש, לחץ סטנדרטי (Pa או N / m 2 ), ומאפשר שחזור, שחזור, והתאוששות סלולרית עקבית. טכניקה זו שימושית במרפאת החוץ כי זה לא כירורגי, קל לביצוע מהיר. זהו מכשיר רפואי מסוג I (סטרילי) לפי ההוראה 93/42 / CEE, CE 0499 (SNCH). זה רק דורשS ההרדמה אקטואלי במהלך ההליך, אשר מבטיח שמירה על שלמות של משטח העין. בעקבות IC, תאים ניתן לעבד מיד cytometry הזרימה. יתר על כן, זה אפשרי עבור אופתלמולוגיה טכנאים ואחיות להיות מאומן למדגם את פני העין.
למרות השיפור של IC על פני טכניקות אחרות, נותרו מספר אתגרים. לדוגמה, ייתכן שיש וריאציה עקב אזור הדגימה והבדלים אזוריים של הלחמית bulbar בהתאם למיקום של IC. מקור נוסף של וריאציה נובע מיישום של לחצים שונים במהלך IC. בעיות מתודולוגיות אחרות כרוכות בסטנדרטיזציה של עיבוד התאים: אלה כרוכות בשיטה ובשיטה של קיבוע, ובתנאי אחסון אפשריים, העלולים להשפיע על היציבות של החומר שנדגמו.
המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לפתח שיטה של בידוד של דגימות הרושם העין thaT הוא קל לשימוש, לא פולשני והוא יכול להיות מיושם על אפיון אימונולוגי של דגימות קליניות.
Protocol
Representative Results
Discussion
זוהי טכניקה קלה, מהירה ופחות פולשנית, שניתן להשתמש בה במרפאות החוץ של המטופלים לצורך איתור פרופיל החיסוני המהיר יחסית לטכניקות הקונבנציונאליות כגון גירוד, ניסור, פיפטינג או נייר סינון סופג 1 , 2 . וריאציה של טכניקה זו כבר בשימוש הגדרות המחקר 22 . היישום העתידי של המתודולוגיה המוצעת הוא עבור ריבוד המטופל בניסויים קליניים עם מחלות עיניים, במיוחד אלו הדורשות אימונופנוטיפינג.
האתגר העיקרי עם טכניקה זו היא תאים חיסוניים מעטים יחסית לאחזר לאחר אוסף רושם ו scraping. המספר הכולל של תאי T3 CD3 התאושש מארבע הופעות לכל אדם מגוון מ ~ 500-1000 תאים. דגימות העין נשטפו לפני ניתוח cytometry זרימה עבור מספר מינימלי של פעמים, כדי למנוע אובדן נוסף של התאS. צעדים קריטיים ואתגרים שנותרו בפרוטוקול הם אוסף יעיל של דגימות עיניים וגירוד הנכון של הממברנה כדי להשיג מספרי תאים גבוהים יותר. עם זאת, הגבלה זו אינה צפויה הטיה כלפי כל פנוטיפ החיסונית ספציפי. פתרון הבעיות שבוצע כאן כדי למקסם את התשואה של התאים היה להפחית את מספר צעדים כביסה לאחר הדגירה של נוגדנים.
קיימות מגבלות אחרות לשימוש ב- IC. בחולים עם משטח העין הקרטני או קשות, כמו בתסמונת סטיבן ג'ונסון, התשואה הסלולרית עשויה להיות אפילו נמוכה מזו שבמחקר זה. חלקם של תאים החיסון עשוי להשתנות אם הדגימות מאוחסנים במקום לנתח באותו יום. קשה לנבא אם סוגי תאים מסוימים עמידים יותר לאחסון מאשר לאחרים. מחקרים קודמים דיווחו על רמות גבוהות של ביטוי HLA-DR בתאי אפיתל הלחמית 23 , כך שזה יהיה interEsting כדי להעריך את המתאם בין HLA-DR לבין רמות של תאים חיסוניים ספציפיים. תאים חיסוניים עשויים להיות קשורים גם עם רמת הביטוי של chemokines. יש להתייחס לנושאים אלה במחקרים עתידיים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לננדיני נאלאפן ולשרון יאו על סיועם בצעדים הטכניים. המחקר מומן על ידי מענק סטארט-אפ ל- KGC מבית הספר לרפואה של לי קונג צ'יאן, אוניברסיטת נניאנג טכנולוגית ועל ידי פרס מדען בכיר של המועצה הלאומית למחקר רפואי במשרד הבריאות של סינגפור (NMRC) ל- LT (NMRC / CSA / 045/2012) ועל ידי מענק מן NMRC ו מנוהל על ידי המרכז הלאומי לחדשנות בריאות כדי KGC ו LT (NHIC-12D-1409007).
Materials
| Reagents | |||
| anti-human CD3 BV510 | BD Biosciences | 563109 | |
| anti-human CD4 APCH7 | BD Biosciences | 641398 | |
| anti-human CD45RO PECy7 | BD Biosciences | 337168 | |
| 7-AAD solution | BD Biosciences | 555816 | |
| anti-human CCR7 PE | BD Biosciences | 552176 | |
| Pippetes | Eppendorf | NA | |
| Local Anaesthesia | Alcaine | NA | |
| Fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Keratograph 5M | Oculus | NA | |
| Slit lamp BioMicroscope | Haag Streit | BM900 | |
| EyePrim | Opia Technologies | NA | |
| FACS Verse | BD BioSciences | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| GraphPad 6.0 | Prism | NA | |
| FACSVerse analysis software | BD | NA |
References
- Thatcher, R. W., Darougar, S., Jones, B. R. Conjunctival impression cytology. Arch Ophthalmol. 95 (4), 678-681 (1977).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84 (6), 798-801 (1977).
- Baudouin, C. The pathology of dry eye. Surv Ophthalmol. 45, S211-S220 (2001).
- Nelson, J. D., Wright, J. C. Conjunctival goblet cell densities in ocular surface disease. Arch Ophthalmol. 102 (7), 1049-1051 (1984).
- Brignole, F., et al. Expression of Fas-Fas ligand antigens and apoptotic marker APO2.7 by the human conjunctival epithelium. Positive correlation with class II HLA DR expression in inflammatory ocular surface disorders. Exp Eye Res. 67 (6), 687-697 (1998).
- Knop, E., Knop, N. The role of eye-associated lymphoid tissue in corneal immune protection. J Anat. 206 (3), 271-285 (2005).
- Lopez-Miguel, A., Gutierrez-Gutierrez, S., Garcia-Vazquez, C., Enriquez-de-Salamanca, A. RNA Collection From Human Conjunctival Epithelial Cells Obtained With a New Device for Impression Cytology. Cornea. 36 (1), 59-63 (2017).
- Tomlins, P., Roy, P., Cunow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival impression for Flow Cytometry. Invest Opthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Barros Jde, N., Almeida, S. R., Lowen, M. S., Cunha, M. C., Gomes, J. A. Impression cytology in the evaluation of ocular surface tumors: review article. Arq Bras Oftalmol. 78 (2), 126-132 (2015).
- Calonge, M., et al. Impression cytology of the ocular surface: a review. Exp Eye Res. 78 (3), 457-472 (2004).
- Haller-Schober, E. M., et al. Evaluating an impression cytology grading system (IC score) in patients with dry eye syndrome. Eye (Lond). 20 (8), 927-933 (2006).
- Singh, R., Joseph, A., Umapathy, T., Tint, N. L., Dua, H. S. Impression cytology of the ocular surface. Br J Ophthalmol. 89 (12), 1655-1659 (2005).
- Williams, G. P., et al. Conjunctival Neutrophils Predict Progressive Scarring in Ocular Mucous Membrane Pemphigoid. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5457-5469 (2016).
- Best, N., Drury, L., Wolffsohn, J. S. Clinical evaluation of the Oculus Keratograph. Cont Lens Anterior Eye. 35 (4), 171-174 (2012).
- Downie, L. E., Keller, P. R., Vingrys, A. J. Assessing ocular bulbar redness: a comparison of methods. Ophthalmic Physiol Opt. 36 (2), 132-139 (2016).
- Amparo, F., Wang, H., Emami-Naeini, P., Karimian, P., Dana, R. The Ocular Redness Index: a novel automated method for measuring ocular injection. Investigative ophthalmology & visual science. 54 (7), 4821-4826 (2013).
- Shapiro, A., Merin, S. Schirmer test and break-up time of tear film in normal subjects. American journal of ophthalmology. 88 (4), 752-757 (1979).
- Finis, D., Pischel, N., Konig, C., Hayajneh, J., Borrelli, M., Schrader, S., Geerling, G. Comparison of the OSDI and SPEED questionnaires for the evaluation of dry eye disease in clinical routine. Ophthalmologe. 111 (11), 1050-1056 (2014).
- Behrens, A. Dysfunctional tear syndrome: a Delphi approach to treatment recommendations. Cornea. 25 (8), 900-907 (2006).
- Williams, G. P., Pachino, A., Long, H. M., Rauz, S., Curnow, S. J. Cytokine production and antigen recognition by human mucosal homing conjunctival effector memory CD8+ T cells. Invest Opthalmol Vis Sci. 55 (12), 8523-8530 (2014).
- Bose, T., Lee, R., Hou, A., Louis, T., Chandy, K. G. Tissue resident memory T cells in the human conjunctiva and immune signatures in human dry eye disease. Sci Rep. 7, 45312 (2017).
- Williams, G. P., et al. The dominant human conjunctival epithelial CD8alphabeta+ T cell population is maintained with age but the number of CD4+ T cells increases. Age (Dordr). 34 (6), 1517-1528 (2012).
- Mrugacz, M., Zak, J., Bakunowicz-Lazarczyk, A., Wysocka, J., Minarowska, A. Flow cytometric analysis of HLA-DR antigen in conjunctival epithelial cells of patients with cystic fibrosis. Eye (Lond). 21 (8), 1062-1066 (2007).
