JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
发育生物学

Çok Elektrodlu Diziler (ÇÇA'lar) Kullanan İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilmiş Kardiyomiyositlerin (hPSC-CM'ler) Elektrofizyolojik Analizi

Published: May 12, 2017
doi:
10.3791/55587
, , , ,
1Department of Anatomy and Embryology,Leiden University Medical Center, 2Department of Applied Stem Cell Technologies,University of Twente

Summary

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden (hPSC-CM) türeyen kardiyomiyositlerin elektrofizyolojik karakterizasyonu, kardiyak hastalık modellemesi ve ilaç yanıtlarının belirlenmesi için çok önemlidir. Bu protokol, hPSC-CM'lerin çok elektrotlu diziler üzerinde ayrılması ve plakalanması, alan potansiyelinin ölçülmesi ve QT ve RR aralıklarının analiz edilmesi için gerekli olan bilgileri sağlar.

Abstract

Artık kardiyomiyositler hem insan embriyonik hem de insan kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden (hPSC) yüksek verimle türetilebilir. HPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin (hPSC-CM'ler), insanlardaki kardiyovasküler hastalıkları, özellikle de aritmi sendromlarını modellemek için büyük bir değere sahip oldukları giderek daha fazla tanınmaktadır. Uyuşturucu yanıtlarını tahmin etmek için in vitro sistemler olarak ilâç taramaları ve keşif, güvenlik farmakolojisi ve belki de sonunda kişiselleştirilmiş tıp için potansiyel olarak yararlı olmasını sağlayan ilacın göstergeleridir. Bu hPSC-CM'leri hastalar veya duyarlı kişilerden hiPSC olarak türetmek suretiyle kolaylaştırılacaktır. Bununla birlikte, tüm uygulamalar için, hPSC-CM elektriksel özelliklerinin kesin ölçümü ve analizi, iyon kanallarını hedef alan ve ani kalp ölümüne neden olabilen kardiyak iyon kanal mutasyonları ve / veya ilaçlardan kaynaklanan değişiklikleri tanımlamak için gereklidir. Manuel patch-clamp ile karşılaştırıldığında, çok elektrotlu dizi (MEA) cihazları,Orta ve yüksek kayıt kapasiteli kayıtlara izin verir. Bu protokol, hPSC-CM'lerin 2D hücre kültürlerinin küçük agregalara ve tek hücrelere ayrılma ve alan potansiyeli olarak kendiliğinden olan elektriksel aktivitelerini kaydetmek için ÇKA'larda plakalamakta olduklarını açıklamaktadır. QT ve RR aralıkları gibi spesifik parametreleri çıkartmak için kaydedilen verilerin analiz yöntemleri de burada açıklanmaktadır. Bu parametrelerdeki değişiklikler, kardiyak aritmilerden sorumlu mutasyonları taşıyan hPSC-CM'lerde ve belirli ilaçların eklenmesinden sonra kardiyotoksik bir riskin bulunduğu kişilerin saptanmasına izin verirken beklenebilir.

Introduction

İnsan Pluripotent Kök Hücreler (hPSCs) kendini yenileme ve farklılaşma 1 , 2 yoluyla insan vücudunun neredeyse herhangi bir hücre türünü oluşturma kapasitesine sahiptir. HPSC'lerin birkaç kardiyak soyuna (ventriküler, atriyal, pacemaker benzeri kardiyomiyosit) doğrudan farklılaşması üzerine ayrıntılı protokoller 3 , 4 , 5 , 6 , 7 olarak tanımlanmıştır. Kardiyomiyositler elektriksel olarak aktif hücrelerdir ve elektrofizyolojik aktivitelerinin ayrıntılı bilgisi, kalp gelişimi ve hastalığını anlamada son derece bilgilendirici olabilir8. Hastaya özgü hiPSC türevli kardiyomiyositleri (hiPSC-CM'ler), Long QT Sendromu da dahil olmak üzere çeşitli kardiyak aritmilerin hücresel, moleküler ve elektriksel özelliklerini modellemek ve araştırmak için başarıyla kullanılmıştır(LQTS) 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , Brugada sendromu 14 ve katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardi 15 , 16 . Dahası, terapötik müdahaleyi tekrarlamak ve hücresel patolojik fenotip 10 , 15 , 20 , 21 , 22'yi kurtarmak için hastalıklı hiPSC-CM'lere çoklu ilaçlar eklenmiştir. Daha yakın zamanlarda, kemirgen kardiyomiyositlerin hu'dan oldukça farklı olduğu için ilaç keşfinin erken safhalarına insan sistemlerine duyulan ihtiyaca cevap olarak, WT hiPSC-CM'lere dayanan tarama platformları geliştirilmiştir ( 23 , 24 , 25)İyon kanalı ekspresyonunda ve biyofizikteki mansörler 26 .

Bu amaçla, orta-yüksek verimli uygulama için uygun teknolojiler geliştirilmekte ve uygulanmaktadır. Bunlar zar potansiyelinin, Ca 2+ geçici ve gerginlik, empedans ölçümleri (hücre kontraktilitesinin dolaylı bir ölçümü) ve hücre dışı alan potansiyelinin (FP) ölçümleri için optik kayıtları içerir (gözden geçirme için bkz. Referans 24 ). Çok elektrotlu Diziler (MEA) cihazları, tek katmanlı veya kardiyomiyositlerin küçük kümeleri tarafından üretilen ve şekillendirilen elektriksel dalga sinyallerini (veya FP'ler) kaydetmeyi sağlar. FP konturu, kardiyak aksiyon potansiyeli ve bir dereceye kadar elektrokardiyogram (EKG) kayıtları 27 ile korelasyon gösterir; Na + akışı ve membran depolarizasyonu (R / Q tepe), muhtemelen Ca'ya tekabül eden yavaş bir dalga / plato fazına karşılık gelen bir başlangıç ​​hızlı yükseliş gösterirler2 + akış ve baskın bir K + efflux (T tepe) karşılık gelen bir repolarizasyon fazı. FP dalga biçiminin dalgalanması, spesifik aksiyon potansiyel evrelerindeki değişikliklerle ilişkilendirilebilir 28 .

Hareket potansiyellerinin patch clamp kayıtları, özellikle yukarı strok hızı ve dinlenme membran potansiyeli gibi parametreler için daha bilgilendirici olabilmesine rağmen, otomatik patch kelepçesi sadece kısa bir süre önce hPSC'ye uygulanmışken orta ve yüksek geçiş skalasındaki deneyler için manuel ölçümler uygulanabilir değildir – 29 . Bununla birlikte, ÇÇ'larda uzatılmış kayıtlar hem akut hem de kronik olarak incelenecek bileşiklere maruz bırakıldığından, ilaç taraması, keşfi 24 , 30 için ve güvenlik farmakolojisi için 31 , 32 için hPSC-CM platformlarını kullanmak artık mümkün. Bu, gelecek hassasiyet veya perso sözünü tutar.Tıp 33 .

Bu protokolün amacı, hPSC-CM'lerin MEA cipslerinde ayrılması ve kaplanması ve FP'lerinin ölçülmesi için gerekli bilgileri sağlamaktır. Bu prosedürde, her adım, optimal hücre sağkalımı ve ayrışmadan sonra toparlanma, MEA plakasına optimal hücre eklenmesi ve standartlaştırılmış analiz ve parametrelerin nicelleştirilmesi sağlanarak optimize edilmiştir. Özellikle, hücre dışı FP kaydı prosedürü, QT ve RR aralıklarının analizi ve ilaç etkilerinin değerlendirilmesi açıklanır ve örneklendirilir.

Protocol

1. Çözeltilerin ve Reaktiflerin Hazırlanması Tablo 1'de açıklanan reaktifleri birleştirerek düşük insülin, sığır serum albümini, polivinilalkol, gerekli lipidleri (LI-BPEL) ortam 34 , 35 , 36 kullanarak hPSC-CM kültür ortamı hazırlayın. Ortamı 0.22 um gözenekli bir filtreden geçirin ve 2 haftaya kadar 4 ° C'de saklayın. İnsan rekombinant fibronektin stok solüsyonunu, 200 μg / mL konsantrasyonuna, alikuotu elde etmek için 5 mL steril damıtılmış suda 1 mg insan rekombinant fibronektini hazırlayarak hazırlayın ve -80 ° C'de saklayın. 100 mL sıcak (~ 40-45 ° C) 1 g enzim deterjan tozu çözülüp mikroarray çipinden kalıntı hücrelerin uzaklaştırılmasına yardımcı olmak için% 1 (w / v) enzim deterjan çözeltisi hazırlayın (bkz . Malzeme Tablosu ) Deiyonize su. Çözeltinin soğumasını bekleyin ve 4 ° C'de depolayın fVeya bir yıla kadar. 2. MEA Cipslerinin sterilizasyonu (Şekil 1A) NOT: MEA'ların birkaç farklı konfigürasyonu mevcuttur; bunlar tek veya çok kuyu formatları ile birlikte verilmektedir. Burada açıklanan protokol, 8 x 8 ızgaralı düzenlemede 60 kayıt elektrodu içeren tek odacıklı MEA'yı kullanır (bkz . Malzeme Tablosu ). Elektrot çapı 30 μm'dir ve elektrotlar arasındaki mesafe 200 μm'dir. Bir referans elektrot da mevcuttur. Çipi deiyonize suyla iyice durulayın. MEA cipsini, otoklavlanabilir cam bir Petri kabına koyun. Çanağı alüminyum folyoya sarın. Fişleri bir laboratuar basınçlı ocakta 6 dakika boyunca sterilize edin. Açmadan önce bulaşıkları soğumaya bırakın. NOT: Alternatif olarak, cipsler, oda sıcaklığında 15-30 dakika boyunca 1 mL% 80 (h / h) etanol içine batırmak suretiyle sterilize edilebilir. Fişleri hücre kültürü kaputuna yerleştirin veYüzeyden yaklaşık 30 dakika boyunca UV ışınlarına maruz bırakın. 3. MEA Cipsinin Kaplanması (Şekil 1B ve 1C) Temiz cipsleri standart 10 cm Ø plastik steril Petri kabı içine yerleştirin. Petri kabına 8 mL steril damıtılmış su ekleyin, nemlendirilmiş bir oda oluşturmak için, inkübatöre yerleştirildiğinde çip üzerinde küçük kültür ortamı hacmini önleyecektir. Elektrot dizisinin bulunduğu çipin merkezinde kardiyomiyositlerin kaplanmasını sağlamak için ısmarlama polietilen fluoroetilen (PTFE) halkaları kullanın ( Şekil 1B ). (PTFE halkaları daha önce% 80 etanol içinde depolanmıştır.) Kültür kaputunda, halkaları etanolden çıkarın, bir kap olmadan steril bir Petri kabı içine yerleştirin ve kaputların içinde halkaların kurumasına izin verin. Ateşle sterilize edilmiş cımbız kullanarak bir MEA çipinin içine kuru bir halka yerleştirin ( Şekil 1C ). NOT: Cımbızı yıkamak için alternatif olarak% 80 etanol kullanın ve iBunları kullanmadan önce doku kültürü kaputuna. İnsan rekombinant fibronektin stokunun bir kısmını (damıtılmış suda 200 μg / mL) çözündürün ve 40 μg / mL'lik bir çalışma solüsyonu elde etmek için Ca 2+ ve Mg 2+ ile PBS'de seyreltin. Ring içine 40 μg / mL fibronektin 50 mcL eklemek elektrotlar kaplayın. NOT: İnsan rekombinant fibronektini kullanarak kaplama optimal hPSC-CM eklenmesini sağlar. Bununla birlikte, sığır fibronektini veya hücre dışı matris proteinleri karışımları gibi diğer kaplama protein türleri de kullanılabilir. 10 cm Ø plastik Petri kabının kapağını kapatın ve MEA yongasını içeren çanağı inkübatöre dikkatle aktarın. 37 ° C'de en az 1 saat veya 4 ° CO / N'de inkübe edin. MEA çipini içeren çanağı hücre kültür kapağına aktarın. MEA çipini kullanmadan önce PTFE halkasını yerinden oynamadan kaputun içine bir P200 pipet veya bir vakum sistemi kullanarak 50 μL fibronektini aspire edin. Pla kullanBu adım için stic ipuçları. Elektronlara zarar verebileceğinden katı nesnelerin ( örn. Pipet uçları) tabağın içine dokunduğundan emin olun. NOT: Bu MEA cipsinin ömrünü uzatacaktır. Nazikçe 950 μL LI-BPEL ortamı ekleyin ( Tablo 1'e ve Malzeme Tablosuna bakın ), eşit dağılıp halkanın yüzdürülmediğinden emin olun. Çanağı inkübatöre geri döndürün. 4. hPSC-CM'nin Ayrılması ve Kaplaması (Şekil 2) NOT: Burada açıklanan protokol, farklılaşmaya başlamadan ~ 18 gün sonra sitokinler 34 kullanarak tek tabaka kültüründe farklılaşan hPSC-CM'leri kullanır. Bununla birlikte, herhangi bir 2D ve 3D hPSC-CM kültürü için uygun olduğu kanıtlanmıştır. Farklılaşmış kültürleri daha erken veya daha ileri zaman noktalarında kullanırken, ayrışma enziminin inkübasyon süresini ayarlamak (bkz . Malzeme Tablosu ) ne olabiliryapanlara. Aşağıdaki ciltler, 12 oyuklu plaka formatında (3,8 cm2) tekli kuyu için tasarlanmıştır. Ortamı hPSC-CM kültüründen de aspire edin. Bir doku kültürü kaputu altında çalışırken, kültürü yıkamak için Ca 2 + / Mg 2 + olmadan PBS 1-2 mL / kuyucuk ekleyin. PBS'yi aspire. Ayrışma enziminden 500 μL / oyuk ekleyin. 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Enzimi sulandırmak için 1 mL LI-BPEL / kuyu ekleyin. Bir P1000 pipet kullanarak hafifçe çizerek hPSC-CM'lerin tek katmanını hafifçe ayırın. 15 mL tüp içinde hücre süspansiyonu toplayın. Kalan tüm hücreleri ve hücre yığınlarını toplamak için 1 mL LI-BPEL ile çalkalayın. 5-6 mL'lik nihai bir hacme ulaşmak için 2-3 mL'lik bir LI-BPEL ekleyin ve hücre yığınlarını ayırmak için 5 mL'lik pipetle 3-5x'lik dereceli pipetle aşağıya ve aşağıya pipetleyin. NOT: Bu noktada tekli hücrelere ayrılma gerekli değildir, çünkü hücre sağkalımını etkileyecektir. Küçük kümelerin varlığıDaha yüksek hücre yaşayabilirliğini sağlayın. Hücreleri oda sıcaklığında 300 x g'de 3 dakika santrifüjleyin. Fazla sıvının çoğunu almaya çalışırken hücrenin peletini çıkarmadan süpernatanı çıkarın. Hücre pelletini 250 mcL LI-BPEL'de (bir P1000 kullanarak ve son derece yavaş pipetleme) tekrar süspanse edin. Elektrot dizisinin üstünde, PTFE halkasının merkezine doğrudan hücre süspansiyonu pipetle konarak, MEA başına ~ 50 μL hücre süspansiyonu dağıtın (en fazla 5 MEA, bir 12 oyuklu plakanın bir kuyusundan hazırlanabilir) dağıtın. NOT: Bu aşamada, hücre kümelerinin varlığı nedeniyle hücrelerin sayımı zordur ve kullanılan MMS başına toplam hücre sayısı, kullanılan hPSC-CM kaynağına bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir. Kaplama yapılırken ayrışmış hücrelerin bulutunun elektrot alanını kapladığından emin olun. ÇÇ'ları 37 ° C'de inkübatöre dikkatli bir şekilde aktarın ve hücrelerin O / N 5. Zil Kaldırma ve Orta ReTazeleme (Şekil 3) Kaplamadan 1 gün sonra steril cımbız kullanarak halkayı dikkatlice çıkarın ( Şekil 3A-3B ). Yüzeyi% 80 (v / v) etanol içinde durulayın ve taze% 80 (v / v) etanol içeren 50 mL tüp içinde saklayın. MEA çipinden hafifçe 500 μL ortamı çıkarın ve 500 μL taze LI-BPEL ekleyin. ÇÇ'ları inkübatöre 37 ° C'de aktarın. NOT: Hücrelerin çıkarılması ve orta derecede değişimden sonra 1-7 gün içerisinde hücrelerin atılması başlamalıdır ( Şekil 3C ). Halka kaldırılmasından 1-7 gün sonra MEA'lardaki hPSC-CM'lerin elektriksel aktivitesini ölçün. 6. Sinyal Kalitesini Kontrol Edin (Şekil 4) Bilgisayarı açın ve MEA kurulumuyla bağlantılı yazılım paketini başlatın: TCX-Control, MC_MEA Select ve MC_Rack. Fizyolojik sıcaklıkta ölçümleri kaydetmek için sıcaklığı TCX-Control'de 37 ° C'ye ayarlayın. MEA yongasını içeren çanağı f çıkarın fKuluçka makinesinde. Kapağı açın, MEA çipini çıkarın ve artık suyu absorbe etmek için bir mendil üzerine koyun. Plakanın harici temas noktalarını bir doku ile silin ve sinyal gürültüsüne neden olabilecek kalan su veya artıkları temizlemek için% 100 (v / v) etanolle nemlendirilmiş pamuklu çubuk kullanarak temizleyin. Spontan aktiviteyi tespit etmek için MEA plakasını ısıtılmış (37 ° C) kayıt başlığına aktarın ( örneğin, donanım: Malzeme Tablosu : yazılım: MC_Rack). MC_Rack'i açın: Yeni bir protokol oluşturmak için 'Düzenle' → 'MC_Card ekle'yi tıklayın. Protokole farklı Kaydedici ve Görüntü pencereleri eklemek için açılır menüden 'Düzenle'yi kullanın. NOT: En az 10 kHz'lik bir örnekleme frekansı önerilir. Kullandığımız protokol, tüm MEA yongasının tam bir düzenine sahip bir Uzun Vadeli Görüntüleme Aracı ve ilaç etkisi i'yi yakalamak için gerekli olan bir Spike Sıralayıcısı içerirGerçek zamanlı değil. Spike Cutout, 20 ms'lik "Ön Tetikleyici", 800 ms'lik "Post Tetikleyici" ve 2 ms'lik "Ölü Zaman" ile ayarlanır. Protokol, '.rck' dosyası olarak kaydedilebilir ve denemelere başlamadan önce yeniden yüklenebilir. Protokolü oynatma modunda 'oynat' düğmesine tıklayarak başlatın. NOT: Bu noktada, adım 6.5'te kaydedilen protokolü yeniden yüklemek mümkündür. MC_Rack'te 'Dosya' → 'Aç' düğmesini tıklayarak protokolü (.rck dosya uzantısı) yükleyin. Sinyaller açıkça görülebilen R tepeleri ve T tepeleri sergiliyorsa, uyum aşamasını tamamlamak için 10-15 dakika bekleyin. İyi ve kötü kalite izlerinin örnekleri Şekil 4'te gösterilmektedir. NOT: Elektrotlardan herhangi birinde T-pik tespit edilemiyorsa deneyle devam etmeyin. Genellikle bu, hPSC-CM'lerin zayıf elektriksel aktivitesinin veya hücrelere elektrotlara kötü bağlanmanın sonucudur. 7. Ex'yi başlatPeriment ve Kayıt 'Kaydet' ve ardından 'oynat'ı tıklayın ve sabit durumu belirlemek için temel koşullar altında 10 dakika boyunca veri edinin. En iyi sinyali olan elektrotlara dikkat edin, böylece daha kolay tespit edilebilir ve analiz için daha sonra ihraç edilebilir. İlaç yanıtı değerlendirmesi için her 10 dakikada bir artan konsantrasyonda ilaç ekleyin. Örnek olarak, 1 μM'lik bir son konsantrasyonda hERG bloke edici E4031 ekleyin. Bunun için, 100 uL ortamı çıkarın ve ortamda çözülmüş 10 uM E4031'in aynı hacmini ekleyin. NOT: Daha önce Cavero ve meslektaşları tarafından gösterildiği üzere, ilaçların yanıt verme eğrisini derinden değiştirebildiğinden, ilaçların eritildiği hacmin bilge bir seçimi önemlidir. İlgilenen tüm diğer ilaç konsantrasyonları için adım 7.2'yi tekrarlayın. Protokolün sonunda kayıtları tamamlamak için 'durdur' düğmesini tıklayın. 8.MEA Yeniden Kullanım İçin Temizleme Deneme kaydı tamamlandıktan sonra, ortamı bir P1000 pipetle hafifçe çıkarın. Elektrodlara zarar verebileceğinden kabın içine dokunmayın. Yerel güvenlik kurallarına göre atın. MEA cipsini deiyonize suyla bir bardak yıkama şişesiyle durulayın ve yıkama adımını 3-4x tekrarlayın. NOT: Bu noktada, hücrelerin çipten tamamen ayrılması gerekli değildir. Her bir göz içine 1 mL enzim deterjan çözeltisi% 1 (v / v) ilave edin ve hücre ayrılmasına ve hücre çıkarılmasına izin vermek için 4 ° C'de O / N inkübe edin. Bir gün sonra, enzim deterjanı çözeltisini ve artık hücreleri çıkarmak için MEA cipsini deiyonize su ile iyice durulayın ve 1 mL deiyonize su ekleyin. Temiz MEA cipsi, deiyonize suyun içine batırılmış olarak 4 ° C'de saklanabilir. 9. Veri Dışa Aktarımı MEA kurulumuna bağlı MC_Data Tool yazılımını açın. 'Dosya' → 'Açık MC'yi tıklayınD',. 'Araçlar' → 'MCD'yi ABF'ye Dönüştür'ü tıklayın . Analiz için ihraç edilecek en iyi kayıt sinyalleri ile elektrotları seçin. Dışa aktarılan dosyaları kaydedeceğiniz dizini seçin ve 'Kaydet'i tıklayın. Dışa aktarma işlemi, verilen elektrotların sayısına ve kayıt dosyalarının toplam boyutuna bağlı olarak birkaç dakika sürebilir. 10. Veri Analizi Bir elektrofizyoloji veri toplama ve analiz programını indirin ( örn. PClamp). İşlem tamamlandıktan sonra, analiz yazılımını çalıştırın ( örn. Kelepçe). RR Aralık hesaplaması (Şekil 5). İz üzerinde ilgili bölgeyi tanımlamak için iki dikey imleç yerleştirin. 'Etkinlik saptama' → 'Eşik Araması' seçeneğini belirleyin. Yatay imleç, Şekil 5A'da gösterildiği gibi, nicelenmesi gereken tüm olayları geçmelidir. Tıklayın &# 39; Tamam 've sonra' Tüm Kategoriyi Kabul Et '. Yazılım, daha sonra tüm uygun olaylar için izi arayacaktır. Olayların üstünde mavi işaretler olacak. Ana olay algılama penceresindeki parametreleri ayarlayarak otomatik seçim hassasiyetini ayarlayın. Tüm olaylar otomatik olarak tespit edildikten sonra sonuç penceresine gidin (Pencere → Sonuçlar) ve frekans verilerini içeren "Müdahale Aralığı" sütununu kopyalayın ( Şekil 5B ). QT Aralık hesaplaması (Şekil 6-9): Durağan hal durumundayken bir imleci sağa ve arkasından tek bir FP'ye yerleştirin. 'Olay Algılama' → 'Şablon Oluştur'u seçin ( Şekil 6 ) . FP'nin doğru tanımlandığını kontrol edin ve 'Ekle'yi tıklayın. Şablon alt panele taşınacaktır. Şablonu '.atf' olarak kaydedindosya. Bu şekilde, yazılım tarafından tüm kayıt boyunca aranacak bir şablon izi oluşturuldu ( Şekil 7 ). Her bir durum için bir şablon oluşturun çünkü bir ilaç etkisi FP'nin şeklini değiştirebilir. Gerekirse izi, iki imleç içinde en fazla 10.000 nokta içerecek şekilde hafifçe filtreleyin. Şablon '.atf' uzantısıyla kaydedildikten sonra 'Etkinlik Algılama' → 'Şablon Araması' seçeneğini belirleyin ve şablonu yükleyin. Seçilen aralıktaki tüm FP'leri doğru olarak tanımlamak için "Şablon eşleme eşiğini" ayarlayın. Tüm olaylar doğru bir şekilde tanımlandıktan sonra, onları yeni bir '.abf' dosyasına kaydedin. Dosyayı analiz yazılımıyla açın ve otomatik olarak Q / R ve T tepeleri için 'Tepenin Süresi' hesaplayın ( Şekil 8, 9 ). İzler çok gürültülü ise, bir filtre uygulayın. QT aralığını çıkarılarak QT aralığını hesaplayın.Seçilen bir elektronik tablo editöründeki T değerinden Q / R değeri.

Representative Results

Ayrılma ve kaplamadan bir gün sonra, hPSC-CM tabakası, MEA odasının merkezini kaplayan yoğun ve beyaz bir film olarak görülecektir ( Şekil 3A ). Halkanın çıkarılmasından sonra ( Şekil 3B )   Katman yerinde kalmalı ve hafif bir mikroskopta muayene MEA elektrotlarını (müteahhitlik) hPSC-CM tabakası ile örtüşecek şekilde gösterecektir ( Şekil 3C ). Hücrelerin fiziksel ve elektriksel bağlanması nedeniyle, analiz için yalnızca bir elektrot (altın elektrot) kullanılacaktır. Alternatif olarak, embriyo gövdeleri veya mikro dokular gibi 3D yapılarla çalışırken, bunlar fiziksel ve elektriksel olarak ayrılmış olacak şekilde plakalanabilir. Mikroskoptaki görsel inceleme, kümeler arasında herhangi bir fiziksel bağlantı olmadığını ve MEA'larda senkronize edilmemiş R dalgalarının elektriksel birleşmeyi onaylamayacağını doğrulamıştır. Bu cAse, çoklu bağımsız elektrotlar analiz edilebilir. FP izlerinin tipik kayıtları Şekil 4'te gösterilmektedir. Özellikle, iyi kalitede bir iz, Na + akışı ve membran depolarizasyonuna (R / Q tepe) karşılık gelen açık bir zirve, K + efflux'a (T tepe) karşılık gelen berrak bir repolarizasyon fazı ve yüksek Sinyal / gürültü oranı ( Şekil 4A , solda: y-ekseni skalasına dikkat edin ve Şekil 4B ). Kötü kalite izleri ( Şekil 4A , orta) hPSC-CM'lerin MEA plakasına veya zayıf hPSC-CM elektriksel aktivitesine bağlanamaması sonucunda olabilir. Daha iyi bağlanmak için 1-3 gün beklemek sinyali artırabilir; Bununla birlikte, hiç sinyal gelişimi gözlenmiyorsa, bu MEA'yı deneylerden hariç tutmak önerilir. Gürültülü izler ( Şekil 4A , sağ) filtreleme yapıldıktan sonra analiz edilebilir. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> RR aralığının başarılı bir şekilde analizi, tepe saptamayı gösteren ekranın görsel denetimi ile tanımlanabilir ( Şekil 5A, 5B ). Dikey imleçler tarafından tanımlanan zaman aralığında, her tepe noktasına karşılık gelen mavi işaretler bulunmalıdır. Programın bir veya daha fazla zirveyi tanımlamaması durumunda, yatay imleci hareket ettirmeyi ve analizin tekrar yürütülmesini veya algılama ayarlarını yapmayı deneyin. Benzer şekilde, QT aralığının başarılı bir şekilde analizi, FP algılamayı gösteren ekranın görsel denetimi ile tanımlanabilir ( Şekil 7 ). Dikey imleçler tarafından tanımlanan zaman aralığında, her bir FP algılamasına karşılık gelen mavi işaretler bulunmalıdır. Programın bir veya daha fazla FP'yi tanımlamaması durumunda, FP şablonunu yeniden tanımlamaya çalışın ( Şekil 6 ) veya algılama ayarlarını yapın ve analizleri tekrar çalıştırın. Ayrılmış bireysel FP izleri veya ortalamaları (Şekil.E 8), Şekil 9'daki gibi belirli ayarlarla QT aralığı değerlerini elde etmek için kullanılabilir. Hastalıklı ve WT hPSC hatlarında ( Şekil 10A ) QT-RR ilişkisinin analizi önerilir ve anlamlıdır ve QT aralığı düzeltmelerinin ( Şekil 10B-10D ) gereksinimini ve / veya etkisini değerlendirmek için kullanılır. LQTS'ye neden olan mutasyonları taşıyan hPSC-CM'lerin, WT kontrollerine kıyasla QT aralıklarının uzaması vardır ( Şekil 11A ). Bir hERG bloke edici ile hPSC-CM'lerin tedavisi, QT aralığında uzamaya neden olur ( Şekil 11B ); Buna karşılık, bir hERG aktivatörü ile tedavi QT aralığının kısalmasına neden olur ( Şekil 11C ). Son olarak, hPSC-CM'lerin dayak frekansını etkileyen ilaçlarla tedavi, RR aralığındaki bir değişiklik olarak görünmelidir ( Şekil 11D , RR aralık kısalması). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55587/55587fig1.jpg" /> Şekil 1: MEA Cipslerinin Sterilizasyonu ve Kaplanması. ( A ) MEA çipini bir otoklavlanabilir cam petri kabı içerisine yerleştirmek, alüminyum folyoya sarmak, 6 dakika süreyle buharlaştırmak ve 30 dakika UV'ye maruz bırakılması dahil olmak üzere sterilizasyon işlemini temsil eden şema. ( B ) Özel PTFE halkanın üst (sol panel) ve yan (orta panel) görüntüleri; Halkanın MEA çipinin merkezinde yerini belirleyen 4 kanat dahil olmak üzere 1.2 cm'lik bir dış çapa ve iç çapı 0,4 cm'dir (sağ panel). ( C ) Çipin standart plastik bir Petri kabına yerleştirilmesi, MEA bölmesinin dışına 8 mL deiyonize su ilave edilmesi, PTFE halkasının bölmenin ortasına yerleştirilmesi ve elektrot dizisinin fibronektin ile kaplanması da dahil olmak üzere MEA çipinin hazırlanmasını temsil eden şematik . İnkübasyon süresinden sonra, fibronektin çıkarılır ve kültür ortamı ile değiştirilir.T = "_ blank"> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 2: hPSC-CM'lerin Ayrılması ve Kaplanması. HPSC-CM'lerin enzimatik ayrışma, santrifüjleme, yeniden süspanse etme ve MEA odasının merkezinde kaplama işlemlerini temsil eden şematik. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 3: hPSC-CM Katmanlı MEA Cipsleri. ( A ) Halkayı ve hPSC-CM katmanını içeren MEA çipinin üst görüntüleri. ( B ) halkanın sökülmesinden sonra MEA çipinin yandan görünümü. ( C ) hPSC-CMs tabakasının parlak alan görüntüsü,Elektrod dizisi; 4X büyütme. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 4: hPSC-CM'lerin MEA Kayıtları. ( A ) MEA ile kaydedilen, R / Q ve T tepeleri ile yüksek sinyal / gürültü oranı (solda), net olarak görülebilen R / Q ve T tepeleri olmayan orta kaliteli iz (orta) ile iyi kalitede iz gösteren temsilci izleri, Ve R / Q ve T tepeleri ile açıkça görülebilen ama düşük sinyal / gürültü oranıyla (sağda) gürültülü bir iz. ( B ) HPSC-CM'leri kullanarak MEA deneyleri sırasında kaydedilebilen farklı morfolojilere sahip kaliteli FP izlerinin temsili örnekleri. Gölgeli alan, analiz sırasında ölçülen QT aralığını temsil eder. MEA'daki FP, ilk derivativ'e benzediğindenE, aksiyon potansiyeli 28 , FP noktasının integralini kırmızı noktalı çizgi şeklinde göstererek, tam bir aksiyon potansiyelinin repolarizasyonuna yakın bir T dalgası seçiminin teorik gösterimi olarak hesapladık. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 5: RR Aralık Hesaplaması. ( A ) Analiz yazılımını kullanarak otomatik pik saptama (üst) ve veri çıkarma (alt) ile RR aralığı analizi örneği (Bkz. Materyal Tablosu). Dikey imleçler, ilgi alanının zaman aralığını tanımlar ve yatay imleç, algılanan ve mavi işaretlerle tanımlanan tüm olayları geçmektedir. ( B ) Büyütülmüş sütun, RR aralığını hesaplamak için kullanılan çıkarılan verileri gösterir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 6: FP Şablonunun Yaratılması. Tek bir FP öncesi ve sonrasında yerleştirilen dikey imleçleri kullanarak şablon seçimi örneği. Bu şablon FP otomatik tanımlama için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 7: FP Şablon Otomatik Tanımlama. İki dikey imleç tarafından tanımlanan aralık boyunca şablon aramaya örnek. Tespit edilen tüm olaylar mavi işaretlerle tanımlanır ve otomatik olarakY ekte üst üste bindirildi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 8: FP Parametrelerinin Nicelleştirilmesi. Kaydedilen olayların analizi, ilk iki imleç içinde manuel olarak belirlenen R tepe noktası ve son iki imleç içinde el ile tanımlanan T tepe noktası. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 9: Analiz Penceresi. R pik tespit etmek için İstatistikler penceresinde kullanılan parametreler. T zirve tespiti için imleçleri değiştirin ve (gerekirse) porağbet görürdü. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 10: QT-RR İlişkisi. ( A ) WT (LQT1 corr ) ve Uzun QT sendromu tip 1 (LQT1 R190Q ) hPSC -CM'ler arasındaki QT ve RR aralıkları arasındaki farklı ilişki örneği. Gölgeli alanlar, RR aralığındaki aynı kaymanın, LQT1 hasta hattının QT aralığında daha büyük bir kayma meydana getirdiğini ve dolayısıyla aritmiye duyarlılığın arttığını göstermektedir. ( B ) 7 değişik hPSC hattından CM'lerde MEA'da ölçülen düzeltilmemiş QT ve RR aralıkları arasındaki ilişki. Bazett'in ( C ) veya Fridericia'nın ( D ) formüllerine QT düzeltmesinin etkisi gösterilmiş ve içinde QT-RR eğiminde değişiklik olarak görülebilir Terval ilişki. Şekiller referans 30'dan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 11: Hastalık veya İlaca Bağlı QT ve RR Aralık Varyasyonları. ( A ) Uzun QT Sendromu (LQTS) mutasyonu taşıyan bir hastadan türetilmiş hPSC-CM'deki QT aralığının uzatılması örneği, izogenik WT kontrolüne kıyasla. ( B ) Farmakolojik hERG bloğu üzerine hPSC-CM'deki QT aralığının uzatılması örneği. ( C ) artan dozlarda hERG aktivatörü ile tedavi üzerine QT aralığı kısalması. Ok, kısalmanın yönünü belirtir. ( D ) İlaca bağlı RR aralığı kısalması örneği. Panel (C) referans olarak uyarlanmıştır.> 30. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Düşük insülin, BSA, polivinilalkol, esansiyel lipitler (LI-BPEL) Orta Bileşen 100 mL için miktar IMDM 43 mL F12 43 mL Askorbik Asit 2-fosfat (damıtılmış suda 5 mg / mL) 1 mL Hücre kültürü takviyesi (L-glutamin için doğrudan yer değiştirme) 1 mL Penisilin / Streptomisin 0.5mL Fenol kırmızısı 1 mg Proteinsiz Hibridoma Orta-II (PFHMII) 5 mL BSA (IMDM içinde ağ / hac% 10) 2.5 mL PVA (damıtılmış su içinde ağ / ağ% 5) 2.5 mL Kimyasal Tanımlı Lipid Konsantresi (CDLC) 1 mL İnsülin-Transferrin-Selenyum-Etanolamin (ITS-X) 100X 0.1 mL Α-Monotiyogliserol (1 mL IMDM içinde 13 uL) 0.3 mL Reaktifleri birleştirin, 0.22 um gözenekli filtre ile filtre edin ve ortamı 2 ° C'ye kadar 4 ° C'de saklayın. Tablo 1: Li-BPEL Ortam Bileşimi.

Discussion

Bu protokol, ÇKA'ları kullanarak FP'yi ölçmek için hPSC-CM'leri nasıl ayrıştırıp hazırlayacağınızı gösterir. HPSC-CM'ler genellikle FP olarak ölçülebilen ve dayak frekansı, QT aralığı süresi ve aritmik olaylar açısından anlamlı veriler sağlayabilen spontan elektriksel aktiviteleri gösterir.

MEA üzerinde dayak katmanın yeniden oluşturulması için 2D kardiyak farklılaşmış kültürlerin ayrışması gereklidir ve kritik bir adımı temsil eder. Tekrarlanan pipetleme ve / veya agresif ayrışma enzim muameleleriyle oluşan mekanik stres, yüksek hücre mortalitesi, MEA plakasına bağlanamaması ve spontan elektriksel aktivitenin olmamasına neden olabilir. Bu protokol tek katmanlı kültürler için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, EB'lerin toplanması, bunu takiben PBS yıkaması ve ayrışan enzim ile daha uzun kuluçka süresi gibi küçük değişikliklerle birlikte üç boyutlu (3D) kültürler ( ör., Embriyot gövdeleri veya EB'ler) için de benzer bir yaklaşım kullanılabilir. İthalatAntite, hem 2D hem de 3D diferansiye kültürlerde, daha yaşlı farklılaşmış hücreler, artmış ekstraselüler matriks birikimi nedeniyle hücrelerin ayrılması için daha uzun inkübasyon süresi gerekebilir.

Burada, FP parametrelerinin nicelleştirilmesi için açıklanan protokol, kardiyoaktif ilaçlar için doz yanıt eğrileri oluşturmak için kullanılabilir. Yakın zamanda Cavero ve ark. 31 , bir ilacın başlangıç ​​konsantrasyonu, bir MEA ölçümünün sonucunu derinden etkileyebilir. Bu nedenle, sonuçların doğruluğunu ve güvenilirliğini arttırmak için aşağıdakileri öneririz: 1) aktive edilemeyen aktivatörler / bloke edicilerde, test edilecek ilacı içeren nispeten geniş hacimde bir ortam kullanın. Daha ayrıntılı olarak orta hacmin% 10-50'sini MEA çipinden çıkarın ve ilacın daha önce uygun konsantrasyonda çözünmüş olduğu eşit hacimde bir ortam ekleyin. Bu durumda, nihai ilaç konsantrasyonunun hesaplanması için,Ortadan kaldırıldıktan sonra konsantrasyon değişimini. 2) Tersinir aktivatörler / bloke edicilerde, 100X stok solüsyondan her bir ilaç dozundan 10 uL ekleyin.

Kardiyak farklılaşma protokollerinin çoğunluğu, nodal benzeri, atriyal benzeri ve ventriküler benzeri kardiyomiyositlerin değişken bir karma popülasyonuyla sonuçlanır ve ventriküler tip en fazla temsil edilir. Bu, kardiyak hastalıkların modellenmesi sırasında belirli bir kardiyomiyosit alt tipini veya kardiyak alt tipe spesifik iyon kanallarına etki eden ilaçları etkilediğinde bir sınırlama oluşturabilir. Birkaç çalışma kalp diferansiasyonu 3 , 5 , 37 , 38 sırasında daha kontrollü spesifikasyonu yönlendiren koşulları iyileştirmiş olmasına rağmen, daha geniş uygulanabilirliği halen araştırılmaktadır.

Dahası, farklılaşmanın değişken verimliliği (farklı deneylerde ve diFferent hPSC hatları) görülebilir 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44 . Yüzey protein ekspresyonu 35 , 45'e (floresan yardımlı hücre ayırma veya manyetik boncuk seçimi 46 , 47 ) ve metabolik seleksiyon 44 , 48'e dayalı kardiyomiyosit zenginleştirme stratejileri, herhangi bir (genetik olarak modifiye edilmiş veya Değiştirilmemiş) hPSC-CM öncesi, elektrik sinyalini geliştirmek için.

HPSC-CM'ler insan erişkin kardiyomiyositleri 4 , 49'a kıyasla bilinen derecede olgunlaşmamış olsalar da, r19 , 20 , 50 spesifik hastalıkla ilişkili değişiklikleri ( örn ., Kanalelopatiler) ve uyuşturucu kaynaklı tepkileri ( örn., Kardiyak iyon kanalı bloke edicileri) tanımlamak ve tanımlamak 4 , 51 . Dahası, olgunlaşmamış hücrelerin ayrışması daha kolaydır ve ayrılma ve kaplamadan sonra yetişkin kardiyomiyositlerden daha iyi iyileşir 44, bu nedenle, hPSC-CM immatitesi bu açıdan bir avantaj olarak ödüllendirilebilir. Bununla birlikte, örneğin tekrarını yapabilmek için. Yetişkin kardiyomiyositlerin ilaç yanıtlarını sadakatle üreterek, daha olgun bir mekanik, metabolik ve elektriksel hPSC-CM durumu elde edilmelidir. Bu hücrelerin olgunlaşması için yöntemler, kültürde 52 uzatılmış süre, mekanik gerginlik 53 , elektriksel hızlanma 54 , küçükMoleküller 55 , 3D-kültür 56 , diğer hücre tipleri 57 ile birlikte kültür ve hatta bu yaklaşımların bir kombinasyonu 58 ; Bugüne kadar bu yaklaşımlardan hiçbiri yetişkin benzeri bir fenotipe yol açmamıştır.

Olgunlaşma özelliklerinin bir parçası olarak, hPSC-CM'ler elektriksel otomatikliği gösterir. Burada, QT ve RR aralıklarının doğru bir şekilde nasıl ölçüleceği konusunda ayrıntılar verilmektedir. Spontan elektriksel aktiviteyi ölçmenin bir sınırlaması, hPSC-CM'ler farklı vuruş frekansları gösterdiğinde QT aralıklarının karşılaştırılmasının zor olabileceğidir. Bu durumda Bazett'in veya Fridericia'nın formülleri, frekans için QT aralığını düzeltmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, daha önce bildirildiği gibi, düzeltme yönteminin kendisinden kaynaklanabilecek herhangi bir yanlılığı hariç tutmak için, ham ve düzeltilmiş veriler için QT aralığına karşı RR aralığı çizilerek Major-Axis regresyon analizinin yapılmasını şiddetle tavsiye ederiz.

Burada sunulan protokol, daha önce açıklanan yöntemler 59 , 60 ile birlikte, hPSC-CM FP'lerin prosedürlerinin ve analizinin standartlaştırılmasına, verilerin tekrarlanabilirliğinin geliştirilmesine ve laboratuarlar arası sonuçların daha iyi karşılaştırılmasına yardımcı olur.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

CVON (HUSTCARE): Hollanda Kardiyovasküler Araştırma Girişimi (Hollanda Kalp Vakfı, Hollanda Tıp Merkezi Federasyonu, Hollanda Sağlık Araştırma ve Geliştirme Organizasyonu ve Hollanda Kraliyet Akademisi); Avrupa Araştırma Konseyi (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC). HPSC kardiyak farklılaşması için yardım için E. Giacomelli'ye (LUMC) teşekkür ediyoruz.

Materials

Biological safety cabinet/laminar flow hood Cleanair
MEA2100 in vitro recording system Multi Channel Systems
CO2 cell culture incubator Sanyo MCO-15A
Centrifuge Hitachi himac-CT6EL
Leica stereomicroscope Leica Microsystems MS5
Handheld pipetman (P-10 (10μL), P-200 (200μL), P-1000 (1000μL)) Gilson International
Filter tips (10 μL, 200μL, 1000μL) Corning 4807 (10 μL), 4810 (200μL), 4809 (1000μL)
Disposable bottle top filter (0.22 μm pore size) Millipore SCGVU02RE
Sterile plastic pipette Greiner Bio-One 606180 (5 mL), 607180 (10 mL), 760180 (25 mL)
Tweezers Dumont
Autoclavable Petri dishes VWR/ Duran Group 391-0860
MEA chip Multi Channel Systems MEA200/30iR-Ti-gr
Phosphate-Buffered Saline (PBS) calcium, magnesium Thermo Fisher Scientific 14040-091
Phosphate-Buffered Saline (PBS) no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190-169
Human recombinant fibronectin Tebu-Bio J64560
Custom made polytetrafluoroethylene (PTFE) MEA rings LUMC: department of Instrument Development
Dissociation enzyme – TrypLE Select 1X Thermo Fisher Scientific 12563-029
Tergazyme enzyme detergent Sigma-Aldrich Z273287-1EA
Distilled Water Thermo Fisher Scientific 15230-089
Name Company Catalog Number Comments
Reagents for LI-BPEL medium
IMDM Thermo Fisher Scientific 21056-023
F12 Thermo Fisher Scientific 31765-027
Ascorbic Acid 2-phosphate Sigma-Aldrich A8960
Glutamax Thermo Fisher Scientific 35050-038
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070-063
Phenol Red Sigma-Aldrich P3532
Protein Free Hybridoma Medium-II (PFHMII) Thermo Fisher Scientific 12040-077
Bovine Serum Albumin (BSA) Bovogen Biologicals Australia BSAS05
Poly(vinyl alcohol) (PVA) Sigma-Aldrich P8136
Chemically Defined Lipid Concentrate (CDLC) Thermo Fisher Scientific 11905-031
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS-X) 100X Thermo Fisher Scientific 51599-056
α-Monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145
Name Company Software version Comments
MC_Rack Multi Channel Systems 4.6.2 Alternatively, data can be recorded using Cardio2D or MC_Experimenter (MultiChannel Systems)
TCX Control Multi Channel Systems 1.3.4
MEA Select Multi Channel Systems 1.3.0
MC_Data Tool Multi Channel Systems 2.6.15 Alternatively, Multi Channel Data Manager (MultiChannel Systems) can be used when custom data export is required (HDF5, EDF, etc.)
Clampfit Molecular Devices 7.0.0 Used in step 10.1 for analyzing, graphing, and formatting of all of data. To use Clampfit, download and install the electrophysiology data acquisition and pClam (latest version, 10.7.0), available on the Molecular Devices Website. Once complete, launch the software Clampfit. Alternatively, data can be analysed using Cardio2D (MultiChannel Systems) or MatLab custom code.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  3. Birket, M. J., et al. Expansion and patterning of cardiovascular progenitors derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (9), 970-979 (2015).
  4. Denning, C., et al. Cardiomyocytes from human pluripotent stem cells: From laboratory curiosity to industrial biomedical platform. Biochim Biophys Acta. 1863 (7 Pt B), 1728-1748 (2016).
  5. Devalla, H. D., et al. Atrial-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells are a robust preclinical model for assessing atrial-selective pharmacology. EMBO Mol Med. 7 (4), 394-410 (2015).
  6. Lewandowski, J., Kolanowski, T. J., Kurpisz, M. Techniques for the induction of human pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes. J Tissue Eng Regen Med. , (2016).
  7. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ Res. 111 (3), 344-358 (2012).
  8. Davies, M. P., An, R. H., Doevendans, P., Kubalak, S., Chien, K. R., Kass, R. S. Developmental changes in ionic channel activity in the embryonic murine heart. Circ Res. 78 (1), 15-25 (1996).
  9. Bellin, M., et al. Isogenic human pluripotent stem cell pairs reveal the role of a KCNH2 mutation in long-QT syndrome. EMBO J. 32 (24), 3161-3175 (2013).
  10. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  11. Ma, D., et al. Modeling type 3 long QT syndrome with cardiomyocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells. Int J Cardiol. 168 (6), 5277-5286 (2013).
  12. Yazawa, M., et al. Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome. Nature. 471 (7337), 230-U120 (2011).
  13. Limpitikul, W. B., et al. A Precision Medicine Approach to the Rescue of Function on Malignant Calmodulinopathic Long QT Syndrome. Circ Res. , (2016).
  14. Liang, P., et al. Patient-Specific and Genome-Edited Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Elucidate Single-Cell Phenotype of Brugada Syndrome. J Am Coll Cardiol. 68 (19), 2086-2096 (2016).
  15. Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Mol Med. 4 (3), 180-191 (2012).
  16. Novak, A., et al. Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation. J Cell Mol Med. 16 (3), 468-482 (2012).
  17. Bellin, M., Mummery, C. L. Inherited heart disease – what can we expect from the second decade of human iPS cell research. FEBS Lett. 590 (15), 2482-2493 (2016).
  18. Sallam, K., Li, Y., Sager, P. T., Houser, S. R., Wu, J. C. Finding the rhythm of sudden cardiac death: new opportunities using induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 116 (12), 1989-2004 (2015).
  19. Sinnecker, D., Goedel, A., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: a versatile tool for arrhythmia research. Circ Res. 112 (6), 961-968 (2013).
  20. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient?. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
  21. Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing. Pharmacol Ther. 143 (2), 246-252 (2014).
  22. Terrenoire, C., et al. Induced pluripotent stem cells used to reveal drug actions in a long QT syndrome family with complex genetics. J Gen Physiol. 141 (1), 61-72 (2013).
  23. Abi-Gerges, N., et al. Assessment of extracellular field potential and Ca2+ transient signals for early QT/pro-arrhythmia detection using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Pharmacol Toxicol Methods. 83, 1-15 (2016).
  24. Del Alamo, J. C., et al. High throughput physiological screening of iPSC-derived cardiomyocytes for drug development. Biochim Biophys Acta. 1863 (7 Pt B), 1717-1727 (2016).
  25. Blinova, K., et al. Comprehensive Translational Assessment of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes for Evaluating Drug-Induced Arrhythmias. Toxicol Sci. , (2016).
  26. Nerbonne, J. M. Studying cardiac arrhythmias in the mouse–a reasonable model for probing mechanisms?. Trends Cardiovasc Med. 14 (3), 83-93 (2004).
  27. Halbach, M., Egert, U., Hescheler, J., Banach, K. Estimation of action potential changes from field potential recordings in multicellular mouse cardiac myocyte cultures. Cell Physiol Biochem. 13 (5), 271-284 (2003).
  28. Tertoolen, L. G., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochem Biophys Res Commun. , (2017).
  29. Rajamohan, D., et al. Automated Electrophysiological and Pharmacological Evaluation of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 25 (6), 439-452 (2016).
  30. Sala, L., et al. A new hERG allosteric modulator rescues genetic and drug-induced long-QT syndrome phenotypes in cardiomyocytes from isogenic pairs of patient induced pluripotent stem cells. EMBO Mol Med. 8 (9), 1065-1081 (2016).
  31. Cavero, I., Guillon, J. M., Ballet, V., Clements, M., Gerbeau, J. F., Holzgrefe, H. Comprehensive in vitro Proarrhythmia Assay (CiPA): Pending issues for successful validation and implementation. J Pharmacol Toxicol Methods. , (2016).
  32. Sala, L., Bellin, M., Mummery, C. L. Integrating cardiomyocytes from human pluripotent stem cells in safety pharmacology: has the time come?. Br J Pharmacol. , (2016).
  33. Chen, I. Y., Matsa, E., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells: at the heart of cardiovascular precision medicine. Nat Rev Cardiol. 13 (6), 333-349 (2016).
  34. Dambrot, C., et al. Strategies for rapidly mapping proviral integration sites and assessing cardiogenic potential of nascent human induced pluripotent stem cell clones. Exp Cell Res. 327 (2), 297-306 (2014).
  35. Elliott, D. A., et al. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nat Methods. 8 (12), 1037-1040 (2011).
  36. Ng, E. S., Davis, R., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. A protocol describing the use of a recombinant protein-based, animal product-free medium (APEL) for human embryonic stem cell differentiation as spin embryoid bodies. Nat Protoc. 3 (5), 768-776 (2008).
  37. Karakikes, I., et al. Small molecule-mediated directed differentiation of human embryonic stem cells toward ventricular cardiomyocytes. Stem Cells Transl Med. 3 (1), 18-31 (2014).
  38. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Res. 21 (4), 579-587 (2011).
  39. Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107 (21), 2733-2740 (2003).
  40. Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108 (3), 407-414 (2001).
  41. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  42. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).
  43. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8 (1), 162-175 (2013).
  44. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  45. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
  46. Fuerstenau-Sharp, M., et al. Generation of highly purified human cardiomyocytes from peripheral blood mononuclear cell-derived induced pluripotent stem cells. PLoS One. 10 (5), e0126596 (2015).
  47. Schwach, V., Passier, R. Generation and purification of human stem cell-derived cardiomyocytes. Differentiation. 91 (4-5), 126-138 (2016).
  48. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  49. Veerman, C. C., Kosmidis, G., Mummery, C. L., Casini, S., Verkerk, A. O., Bellin, M. Immaturity of human stem-cell-derived cardiomyocytes in culture: fatal flaw or soluble problem?. Stem Cells Dev. 24 (9), 1035-1052 (2015).
  50. Karakikes, I., Ameen, M., Termglinchan, V., Wu, J. C. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: insights into molecular, cellular, and functional phenotypes. Circ Res. 117 (1), 80-88 (2015).
  51. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 170-182 (2016).
  52. Otsuji, T. G., Minami, I., Kurose, Y., Yamauchi, K., Tada, M., Nakatsuji, N. Progressive maturation in contracting cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: Qualitative effects on electrophysiological responses to drugs. Stem Cell Res. 4 (3), 201-213 (2010).
  53. Mihic, A., et al. The effect of cyclic stretch on maturation and 3D tissue formation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 35 (9), 2798-2808 (2014).
  54. Lieu, D. K., et al. Mechanism-based facilitated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Arrhythm Electrophysiol. 6 (1), 191-201 (2013).
  55. Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
  56. Mannhardt, I., et al. Human Engineered Heart Tissue: Analysis of Contractile Force. Stem Cell Reports. , (2016).
  57. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19 (6), 783-795 (2010).
  58. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  59. Clements, M. Multielectrode Array (MEA) Assay for Profiling Electrophysiological Drug Effects in Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Curr Protoc Toxicol. 68 (22), 1-22 (2016).
  60. Harris, K. A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte (hiPSC-CM) Multielectrode Array Assay for Preclinical Cardiac Electrophysiology Safety Screening. Curr Protoc Pharmacol. 71, 1-15 (2015).

Tags

Pluripotent Stem Cell-derived CardiomyocytesMulti-electrode ArraysElectrophysiological AnalysisField PotentialDrug ScreeningDissociationCell PlatingFibronectin CoatingPTFE RingLI-BPEL Medium

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sala, L., Ward-van Oostwaard, D., Tertoolen, L. G. J., Mummery, C. L., Bellin, M. Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs). J. Vis. Exp. (123), e55587, doi:10.3791/55587 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image