使用多电极阵列（MEA）的人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CM）的电生理分析

1.溶液和试剂的制备通过组合表1中所述的试剂，使用低胰岛素，牛血清白蛋白，聚乙烯醇，必需脂质（LI-BPEL）培养基34,35,36制备hPSC-CM培养基。通过0.22μm孔过滤器过滤介质，并在4°C下储存长达2周。 通过将1mg人重组纤连蛋白重组在5 mL无菌蒸馏水中，制备人重组纤连蛋白原液，达到200μg/ mL浓度，等分，并储存于-80°C。 准备1％（w / v）酶洗涤剂溶液（参见表格材料 ），以帮助从微阵列芯片中去除残留细胞，将1g洗涤剂粉末溶解在温热（约40-45℃）去离子水。让溶液冷却并储存在4°C f或长达一年。 2. MEA芯片的灭菌（图1A） 注意：可使用多种不同的MEA配置，具有单阱或多阱格式。这里描述的协议使用具有8×8格栅排列的60个记录电极的单室MEA（参见材料表 ）。电极直径为30μm，电极间距离为200μm。还存在一个参考电极。 用去离子水彻底冲洗芯片。 将MEA芯片放入可以进行高压灭菌的玻璃培养皿中。将菜包裹在铝箔上。 在实验室压力锅中灭菌6分钟。打开前让盘子冷却下来。 注意：或者，芯片可以通过将其浸入1mL 80％（v / v）的乙醇中，在室温下灭菌15-30分钟。 将芯片放在细胞培养罩中并暴露表面到紫外光约30分钟。 3.涂覆MEA芯片（图1B和1C） 将清洁的芯片放在标准的10厘米Ø塑料无菌培养皿中。 向培养皿中加入8 mL无菌蒸馏水，形成一个加湿室，放置在培养箱中时可防止芯片上的少量培养液干燥。 使用定制的聚四氟乙烯（PTFE）环（ 图1B ），以确保电极阵列所在的芯片中心处的心肌细胞的电镀。 （PTFE环预先储存在80％乙醇中）。在培养罩中，从乙醇中取出环，将其放入无菌培养皿中，不用盖子，并允许环在发动机罩中干燥。 使用火焰灭菌的镊子将干环放在一个MEA芯片内（ 图1C ）。 注意：或者使用80％乙醇洗涤镊子，并使其干燥使用组织培养罩之前。 解冻一等份的人重组纤连蛋白原液（200μg/ mL，在蒸馏水中），并用Ca 2+和Mg 2+稀释在PBS中，得到40μg/ mL的工作溶液。通过在环内加入50μL的40μg/ mL纤连蛋白来涂覆电极。 注意：使用人重组纤连蛋白的涂层确保了最佳的hPSC-CM附着。然而，可以使用其他类型的包衣蛋白，例如牛纤连蛋白或细胞外基质蛋白混合物。 关闭10厘米Ø塑料培养皿的盖子，并小心地将含有MEA芯片的培养皿转移到培养箱中。在37℃下孵育至少1小时，或以4°CO / N孵育。 将含有MEA芯片的菜转移到细胞培养罩。在使用MEA芯片之前，使用P200移液器或发动机罩中的真空系统抽吸50μL纤连蛋白，而不会移动PTFE环。使用pla这一步的坚定提示。确保没有固体物体（ 例如，移液管尖端）接触盘的内部，因为这可能会损坏电极。 注意：这将延长MEA芯片的使用寿命。 轻轻加入950μLLI -BPEL培养基（ 见表1和材料表 ），确保其均匀分布，并且环不浮动。把菜放回孵化器。 hPSC-CMs解离和电镀（图2） 注意：这里描述的方案使用在开始分化后〜18天使用细胞因子34在单层培养物中分化的hPSC-CM。然而，已被证明适用于任何2D和3D hPSC-CM培养。当在较早或较晚的时间点使用分化培养物时，调整解离酶的孵育时间（参见材料表 ）可能是necessary。以下卷是针对12孔板格式（3.8厘米2 ）的单孔。 从hPSC-CMs培养液中吸出培养基。 当在组织培养罩下工作时，加入1-2mL /孔的没有Ca 2+ / Mg 2+的PBS以洗涤培养物。吸出PBS。 加入500μL/孔的解离酶。在37°C孵育5分钟。 加入1 mL LI-BPEL /孔稀释酶。使用P1000移液管轻轻刮擦，轻轻分离hPSC-CM的单层。将细胞悬浮液收集在15 mL管中。 用1 mL LI-BPEL冲洗井，收集剩余的所有细胞和细胞团。 加入另外2-3 mL的LI-BPEL，达到5-6 mL的最终体积，并用5 mL移液管轻轻移液3-5次，分离细胞团。 注意：在这一点上解离成单个细胞是不必要的，因为它将影响细胞存活。存在小簇将会确保更高的细胞活力。 在室温下以300×g离心细胞3分钟。 去除上清液，试图去除大部分剩余液体，但不会移动细胞团块。 将细胞沉淀物重悬于250μLLI-BPEL（使用P1000和非常温和的移液）。 通过在电极阵列的顶部将细胞悬浮液直接吸取到PTFE环的中心，分配〜50μL的每个MEA的细胞悬浮液（可从12孔板的一个孔中制备多达5个MEA）。 注意：在这个阶段，由于细胞簇的存在，细胞难以计数，每个MEA的细胞总数可以基本上变化，这取决于所用的hPSC-CM来源。电镀时，确保解离细胞的云层覆盖电极区域。 在37℃下小心地将MEA转移到培养箱中，并允许细胞附着O / N 戒指和中等新鲜（图3） 电镀后1天，用无菌镊子在无菌环境下小心地取出环（ 图3A-3B ）。 在80％（v / v）乙醇中冲洗环，并将其储存在含有新鲜80％（v / v）乙醇的50mL管中。 轻轻从MEA芯片中取出500μL培养基，加入500μL新鲜的LI-BPEL。 将MEA转移到37℃的培养箱中。 注意：细胞应在戒除和中等改变后1-7天开始跳动（ 图3C ）。 在戒除后1-7天测量hPSC-CM在MEA上的电活动。 6.检查信号质量（图4） 打开计算机并启动与MEA建立的链接的软件套件：TCX-Control，MC_MEA Select和MC_Rack。将TCX-Control中的温度设置为37°C，以便在生理温度下记录测量值。 取出含有MEA芯片的盘f从孵化器。打开盖子，取出MEA芯片，将其放在纸巾上吸收残留的水分。 小心地用纸巾擦拭板的外部触点，并使用用100％（v / v）乙醇浸湿的棉签清洁它们，以清除任何可能导致信号噪音的残留水或碎屑。 将MEA板转移到加热（37℃）记录头阶段以检测自发活动（ 例如，硬件：参见材料表 ;软件：MC_Rack）。 打开MC_Rack：点击“编辑”→“添加MC_Card”来创建一个新的协议。使用下拉菜单“编辑”将不同的录像机和显示窗口添加到协议中。 注意：建议采样频率至少为10 kHz。我们使用的协议包含一个Longterm显示工具，整个MEA芯片的全面布局，以及一个Spike分选机，捕获药物效应至关重要n实时。 Spike Cutout调谐为20 ms的“Pre Trigger”，“Post Trigger”为800 ms，“Dead Time”为2ms。该协议可以保存为'.rck'文件，并在开始实验之前重新加载。 通过点击“播放”按钮在播放模式下启动协议。 注意：此时可以重新加载在步骤6.5中保存的协议。在MC_Rack中，单击“文件”→“打开”加载协议（.rck文件扩展名）。 如果信号显示清晰可见的R峰和T峰，请等待10-15分钟以得出适应阶段。良好和差质量痕迹的例子如图4所示 。 注意：如果在任何电极中没有检测到T峰，请不要进行实验。通常这是由于hPSC-CM的电活动不良或细胞附着到电极的结果。 7.起始例调查和记录单击“记录”然后“播放”，并在基线条件下获取10分钟的数据，以确定稳态。注意具有最佳信号的电极，以便稍后可以轻松识别和导出以进行分析。 对于药物反应评估，每10分钟加入一定浓度的药物。例如，加入终浓度为1μM的hERG阻断剂E4031。为此，取出100μL培养基，并加入溶解在培养基中的相同体积的10μME4031。 注意：如Cavero及其同事31所述，药物溶解体积的明智选择很重要，因为它可以深刻地改变药物反应曲线。 对所有感兴趣的其他药物浓度重复步骤7.2。 点击“停止”结束协议结尾处的录音。 8。MEA清洁再利用实验记录完成后，用P1000移液器轻轻取出培养基。不要碰到盘子的内部，因为这会损坏电极。根据当地的安全规定丢弃。 使用洗涤瓶用去离子水冲洗MEA碎片，并重复洗涤步骤3-4x。 注意：在这一点上，电池不必完全与芯片分离。 向每个孔中加入1mL（v / v）酶洗涤剂溶液，并在4℃下孵育O / N以允许细胞脱离和细胞去除。 一天后，用去离子水彻底冲洗MEA芯片，以去除酶洗涤剂溶液和残留的细胞，并加入1 mL去离子水。清洁MEA芯片可以储存在4℃的去离子水中。 9.数据导出打开链接到MEA设置的MC_Data工具软件。 点击“文件”→“打开MC”D”。 单击“工具”→“将MCD转换为ABF” 。 选择要输出的最佳记录信号的电极进行分析。选择保存导出文件的目录，然后单击“保存”。导出程序可能需要几分钟，具体取决于导出的电极数量和录制文件的总大小。 数据分析下载并安装电生理数据采集和分析程序（ 如 pClamp）。完成后，启动分析软件（ 例如 Clampfit）。 RR间隔计算（图5）。 放置两个垂直光标以定义跟踪上的感兴趣区域。选择“事件检测”→“阈值搜索”。水平光标应该交叉所有必须量化的事件， 如图5A所示 。 点击＆＃39;确定'，然后“接受整个类别”。然后，软件将搜索所有适当事件的跟踪。蓝点将被放置在事件之上。 通过调整主事件检测窗口中的参数来调整自动选择的灵敏度。 一旦所有事件都被自动识别，请转到结果窗口（窗口→结果），并复制包含频率数据的标题为“Intervent Interval”的列（ 图5B ）。 QT间隔计算（图6-9）： 在稳态条件下，将一个光标放在单个FP之前，然后放置在单个FP之后。选择“事件检测”→“创建模板”（ 图6 ） 。 检查FP是否正确识别，然后单击“添加”。模板将移动到底部面板。 将模板另存为'.atf'文件。以这种方式，已经创建了一个模板跟踪，将在整个记录中由软件进行搜索（ 图7 ）。为每个条件创建一个模板，因为药物效应可能会改变FP的形状。如有必要，请稍微过滤轨迹，以在两个光标中最多包含10.000个点。 一旦使用'.atf'扩展名保存模板，选择“事件检测”→“模板搜索”并加载模板。 调整“模板匹配阈值”，以正确识别所选间隔内的所有FP。 一旦所有事件都被正确识别，将它们保存在一个新的'.abf'文件中。 用分析软件打开文件，并自动计算Q / R和T峰的“峰值时间”（ 图8,9 ）。如果痕迹非常嘈杂，则应用过滤器。通过减去QT间隔计算选择的电子表格编辑器中的T值的Q / R值。