軟骨細胞分化のDNAメチル化レベルを定量化する5-mCドットブロットアッセイ<em>インビトロ</em
Summary
本発明者らは、5-メチルシトシン（5-mC）ドットブロットに基づいてDNAメチル化を定量する方法を提示する。我々は、軟骨細胞脱分化の間の5-mCレベルを決定した。この単純な技術は、ACI治療における軟骨細胞の表現型を迅速に決定するために使用することができる。
Abstract
硝子軟骨細胞の繊維芽細胞様軟骨細胞への脱分化は、しばしばインビトロでの軟骨細胞の単層拡大を伴う。軟骨細胞の全体的なDNAメチル化レベルは、軟骨細胞表現型の喪失に適したバイオマーカーであると考えられている。しかしながら、異なる実験方法に基づく結果は矛盾することがある。したがって、軟骨細胞の脱分化の間の全体的なDNAメチル化レベルを定量化するための正確で単純で迅速な方法を確立することが重要である。
現在のゲノムワイドメチル化分析技術は、主にバイサルファイトゲノム配列決定に依存している。亜硫酸水素塩転換中のDNA分解のために、これらの方法は、典型的には、大きな試料量を必要とする。全体のDNAメチル化レベルを定量するために使用される他の方法には、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）が含まれる。しかしながら、HPLCはゲノムDNAの完全消化を必要とする。さらに、HPLCのコストが非常に高くなります。HPLCの幅広い応用が制限されています。
この研究では、ゲノムDNA（gDNA）を、様々な継代数で培養したヒト軟骨細胞から抽出した。 gDNAメチル化レベルは、メチル化特異的ドットブロットアッセイを用いて検出した。このドットブロットアプローチでは、検出されるべきメチル化DNAを含むgDNA混合物を、先に描かれた円形鋳型パターン内のドットとしてN +膜上に直接スポットした。他のゲル電気泳動に基づくブロッティング法および他の複雑なブロッティング法と比較して、ドットブロット法はかなりの時間を節約する。加えて、ドットブロットは、市販の5-mC抗体を用いて全体のDNAメチル化レベルを検出することができる。本発明者らは、DNAメチル化レベルが単層継代培養の間で異なり、したがって軟骨細胞脱分化に重要な役割を果たすことができることを見出した。 5-mCドットブロットは、一般的なDNAメチル化レベルを検出して評価するための、信頼性の高い簡単で迅速な方法です軟骨細胞表現型。
Introduction
自己軟骨細胞移植（ACI）は、関節軟骨欠損を治療するための比較的新しい、最先端の方法である1,2 。 ACIの重要なステップの1つは、 インビトロでの単層培養による軟骨細胞の増幅である。増幅中、硝子軟骨細胞は容易にその表現型を失い、脱分化し、ACI処置3,4にとって望ましくない。 ACI治療の結果を最適化するために、軟骨細胞脱分化の程度は、再移植の前に決定されるべきである。軟骨細胞の状態を決定する経済的かつ迅速な方法を確立することが不可欠です。近年、DNAメチル化と軟骨細胞の脱分化との関連が注目されている4,5,6。 DNAメチル化は、whメチル基がDNAに付加され、シトシン残基が5-メチルシトシン（5-mC）に変換される。
軟骨細胞の脱分化におけるDNAメチル化の生物学を解明するために、第一段階は軟骨細胞のDNAメチル化レベルを評価することであり、これまで困難であった。バイサルファイトのゲノムシーケンシングは、DNAメチル化を解析するために最も広く使用されている手法です7,8 。このアッセイでは、重亜硫酸塩の変換はDNA分解を引き起こすため、アッセイのために相当量の試料を提供しなければならない。また、グローバルDNAメチル化レベル9,10を定量するために、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）が使用されています。しかしながら、HPLC分析はゲノムDNA消化を必要とする。さらに、高度で高価な実験器具が必要である。したがって、高コストに加えて、これらの実験手順は、時間の短所uming。現在、抗5-mC抗体が市販されており、複合ゲノムからの5-mC含有ゲノムDNAの免疫ブロットの可能性が生じている。
この報告では、一連の単層培養で増殖した軟骨細胞からゲノムDNAを抽出した。本発明者らは、異なる数の継代を有するヒト軟骨細胞における5-mC含量を評価するために、ドットブロットアッセイを使用した。我々は、5-mC含量が、低分化脱分化を伴う軟骨細胞と比較して、高度に脱分化した軟骨細胞において増加することを見出した。さらに、脱分化状態と5-mCレベルとの間の関係を同定した。最後に、我々は、5-mC含量の変化が軟骨細胞の表現型と関連していることを報告した。したがって、5-mCドットブロットアッセイは、軟骨細胞におけるDNAメチル化レベルを検出するための信頼性が高く、簡単で迅速な方法である。
Protocol
Representative Results
Discussion
インビトロでの軟骨細胞脱分化は、軟骨欠損修復の治療におけるACIの結果を著しく損なう11,12 。 ACI結果を最適化するためには、脱分化した軟骨細胞の使用を避けることが重要です13 。研究は、一般的なDNAメチル化レベルが軟骨細胞脱分化の程度に関連していることを示唆している4,6。したがって、臨床応用の前に軟骨細胞の一般的なDNAメチル化状?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、以下のグラントによって支持された：中国の自然科学財団（No. 81572198; No. 81260161; No. 81000460）;広東省自然科学財団、中国（No. 2015A030313772）;中国ポストドクター・サイエンス財団資金提供プロジェクト（No. 2013M530385）;中国広東省の医学研究財団（No. A2016314）;深セン科学技術プロジェクト（No.JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No.JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200）。
Materials
| Reagents | |||
| DMEM | Gibco Inc. | 11965–092 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline(PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, free of |
| Ca2+/Mg2+ | |||
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0.25%Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| 1%Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma | I-3643 | |
| Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| TAE buffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Distilled Water | Gibco BRL | 15230-170 | |
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | C58H114O26 | |
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Names | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment | |||
| Cell Strainer(40μm nylon） | FALCON Inc. | 352340 | |
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | |
| Centrifuge Tubes | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | |
| Chemi-imaging Analyse System | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
References
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
- Pareek, A., et al. Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years. Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).
- Duan, L., et al. Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy. Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).
- Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).
- Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair. Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).
- Duan, L., et al. DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro. J Cell Physiol. , (2016).
- Bhat, S., et al. DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing. Gene. , (2016).
- Shi, X. W., et al. Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips. Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).
- Li, X. L., et al. Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells. J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).
- Maghbooli, Z., et al. Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy. Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).
- Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation. J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).
- Legendre, F., et al. Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia. Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).
- Niethammer, T. R., et al. Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint. Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).
- Hayatsu, H. The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research. Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).
- Haque, N., Nishiguchi, M. Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants. Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
