Immunfluoreszenzanalyse der Stressgranulat-Bildung nach bakterieller Herausforderung von Säugetierzellen

Die Visualisierung von Host-Pathogen-Interaktionen auf zellulärer Ebene ist eine leistungsstarke Methode, um Einblicke in pathogene Strategien zu gewinnen und wichtige Zellwege zu identifizieren. In der Tat können Pathogene als Werkzeuge verwendet werden, um wichtige zelluläre Ziele oder Strukturen zu lokalisieren, da sich Pathogene entwickelt haben, um zentrale zelluläre Prozesse als Strategie für ihr eigenes Überleben oder ihre Ausbreitung zu untergraben. Die Visualisierung von zellulären Komponenten kann durch rekombinante Expression von fluoreszenzmarkierten Wirtsproteinen erreicht werden. Während dies eine Echtzeitanalyse ermöglicht, ist die Erzeugung von Zelllinien mit speziell markierten Wirtsproteinen sehr aufwendig und kann zu unerwünschten Nebenwirkungen führen. Zweckmäßiger ist der Nachweis von zellulären Faktoren, die spezifische Antikörper verwenden, da mehrere Wirtsfaktoren gleichzeitig analysiert werden können und einer nicht auf einen bestimmten Zelltyp beschränkt ist. Ein Nachteil ist, dass nur eine statische Ansicht erfasst werden kann, da die Immunfluoreszenzanalyse die Wirtszell-Fixierung erfordertIon. Ein wichtiger Vorteil der Immunfluoreszenz-Bildgebung ist jedoch, dass sie sich sowohl qualitative als auch quantitative Analysen eignet. Dies wiederum kann verwendet werden, um statistisch signifikante Unterschiede zu erhalten, um neue Einblicke in Host-Pathogen-Wechselwirkungen zu liefern.

Fluoreszierende Bildanalyse-Programme sind leistungsstarke analytische Werkzeuge für die Durchführung von 3D- und 4D-Analysen. Allerdings sind die hohen Kosten der Software und ihre Wartung machen Methoden auf freie Open-Source-Software mehr attraktiv. Eine sorgfältige Bildanalyse mit Bioanalyse-Software ist wertvoll, da sie die visuelle Analyse untermauert und bei der Zuweisung statistischer Signifikanzen das Vertrauen in die Richtigkeit eines gegebenen Phänotyps erhöht. Bisher wurden SGs mit der freien ImageJ Software analysiert, was die manuelle Identifikation einzelner SGs ⁴ erfordert. Hier stellen wir ein Protokoll für die Induktion und Analyse der zellulären SG-Bildung im Rahmen von bac zur VerfügungTerial-Infektionen mit der freien Open-Source-Bio-Bild-Analyse-Software ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). Die Bio-Bildanalyse-Software verfügt über ein eingebautes Spot-Detektor-Programm, das sich hervorragend für die SG-Analyse eignet. Es ermöglicht die Feinabstimmung des automatisierten Erkennungsprozesses in bestimmten Regionen von Interesse (ROIs). Dies überwindet die Notwendigkeit einer manuellen Analyse einzelner SGs und beseitigt die Abtastvorspannung.

Viele Umgebungsbelastungen induzieren die Bildung von SGs, die phasen-dichte zytosolische, nicht-membranöse Strukturen von 0,2 – 5 μm im Durchmesser ^{5 , 6 sind} . Diese zelluläre Antwort ist evolutionär in Hefe, Pflanzen und Säugetieren konserviert und tritt auf, wenn die globale Protein-Translation gehemmt wird. Es handelt sich um die Aggregation von blockierten Translationsinitiationskomplexen in SGs, die als Haltungsplätze für translational-inaktive mRNAs betrachtet werden, was eine selektive Translation einer Untermenge von zellulären mRNAs ermöglicht.Nach der Beseitigung der Belastung, SGs auflösen und globale Preise der Proteinsynthese wieder aufnehmen. SGs bestehen aus Translationsdehnungsinitiationsfaktoren, Proteinen, die an dem RNA-Metabolismus beteiligt sind, RNA-bindende Proteine ​​sowie Gerüstproteine ​​und Faktoren, die an der Wirtszell-Signalisierung ^{2 beteiligt sind} , obwohl die genaue Zusammensetzung in Abhängigkeit von der angewandten Belastung variieren kann. Umwelteinflüsse, die die SG-Bildung induzieren, schließen die Aminosäure-Verhungern, die UV-Bestrahlung, den Hitzeschock, den osmotischen Schock, den endoplasmatischen Retikulumstress, die Hypoxie und die Virusinfektion ^{2 , 7 , 8 ein} . Es wurde viel Fortschritte gemacht, um zu verstehen, wie Viren die SG-Bildung induzieren und auch untergraben, während wenig darüber bekannt ist, wie andere Pathogene wie Bakterien-, Pilz- oder Protozoenpathogene diese zelluläre Stressreaktion ^{1 , 7 beeinflussen} .

ShigeLla flexneri ist ein gram-negatives fakultatives zytosolisches Pathogen des Menschen und der Erreger von schweren Durchfall oder Shigellosis. Shigellosis ist eine große öffentliche Gesundheit Belastung und führt zu 28.000 Todesfälle jährlich bei Kindern unter 5 Jahren im Alter von ^{9 , 10} . S. flexneri infiziert das Kolon-Epithel und verbreitet Zelle-zu-Zelle durch Entführung der Zytoskelettkomponenten des Wirts ^{11 , 12} . Die Infektion des Epithels unterstützt die Replikation von S. flexneri innerhalb des Cytosols, aber infizierte Makrophagen sterben durch einen entzündlichen Zelltodprozess namens Pyroptose. Infektion führt zu einer massiven Rekrutierung von Neutrophilen und einer schweren Entzündung, die von Hitze, oxidativem Stress und Gewebezerstörung begleitet wird. Während also infizierte Zellen internen Belastungen durch Infektion induziert werden, wie z. B. Golgi-Störung, genotoxischer Stress und zytoskeletale UmlagerungS, infizierte Zellen sind auch Umweltbelastungen durch den entzündlichen Prozess unterworfen.

Die Charakterisierung der Wirkung von S. flexneri- Infektion auf die Fähigkeit von Zellen, auf Umweltbelastungen mit einer Anzahl von SG-Markern zu reagieren, hat gezeigt, dass die Infektion zu qualitativen und quantitativen Unterschieden in der SG-Zusammensetzung führt ³ . Allerdings ist wenig über andere bakterielle Pathogene bekannt. Hier beschreiben wir eine Methodik für die Infektion von Wirtszellen mit dem zytosolischen Pathogen S. flexneri , die Beanspruchung von Zellen mit unterschiedlichen Umweltbelastungen, die Markierung von SG-Komponenten und die qualitative und quantitative Analyse der SG-Bildung und Zusammensetzung im Kontext von infizierten Und nicht infizierten Zellen. Diese Methode ist weithin anwendbar auf andere bakterielle Pathogene. Zusätzlich kann die Bildanalyse der SG-Bildung für Infektionen durch Viren oder andere Pathogene verwendet werden. Es kann verwendet werden, um SG zu analysierenBildung bei Infektion oder die Wirkung einer Infektion auf die SG-Bildung als Reaktion auf exogene Spannungen.