Immunofluorescentie analyse van stress granule vorming na bacteriële uitdaging van zoogdiercellen
Summary
We beschrijven een methode voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van stresskorrelvorming in zoogdiercellen nadat de cellen zijn uitgedaagd met bacteriën en een aantal verschillende stressen. Dit protocol kan toegepast worden om de cellulaire stress granule respons te onderzoeken in een breed scala van gastro-bacteriële interacties.
Abstract
Fluorescente beeldvorming van cellulaire componenten is een effectief instrument om interactie tussen gastheer-pathogeen te onderzoeken. Pathogenen kunnen veel verschillende eigenschappen van geïnfecteerde cellen beïnvloeden, waaronder organische ultrastructuur, cytoskeletale netwerkorganisatie, evenals cellulaire processen zoals Stress Granule (SG) -vorming. De karakterisering van hoe pathogenen gastheerprocessen ondermijnen is een belangrijk en integraal onderdeel van het pathogenese veld. Hoewel variabele fenotypes gemakkelijk zichtbaar zijn, is de nauwkeurige analyse van de kwalitatieve en kwantitatieve verschillen in de cellulaire structuren die door pathogeenuitdaging geïnduceerd zijn essentieel voor het definiëren van statistisch significante verschillen tussen experimentele en controle monsters. SG-vorming is een evolutionair geconserveerde stressrespons die leidt tot antivirale reacties en is al lang onderzocht met behulp van virale infecties 1 . SG-vorming heeft ook invloed op signaleringskascades en kan nog andere onbekende conseq hebbenUences 2 . De karakterisering van deze stressrespons op andere pathogenen dan virussen, zoals bacteriële pathogenen, is momenteel een opkomende onderzoeksgebied 3 . Momenteel is de kwantitatieve en kwalitatieve analyse van SG-vorming nog niet routinematig gebruikt, zelfs in de virale systemen. Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor het induceren en karakteriseren van SG-vorming in niet-geïnfecteerde cellen en in cellen die zijn geïnfecteerd met een cytosolisch bacterieel pathogeen, dat de vorming van SG's beïnvloedt in reactie op verschillende exogene stressen. Analyse van SG-vorming en samenstelling wordt bereikt door gebruik te maken van een aantal verschillende SG markers en de spotdetector plug-in van ICY, een open source beeld analyse tool.
Introduction
Het visualiseren van gastropathogene interacties op cellulaire niveau is een krachtige methode om inzicht te krijgen in pathogene strategieën en voor het identificeren van belangrijke cellulaire pathways. Inderdaad kunnen pathogenen worden gebruikt als instrumenten om belangrijke cellulaire doelen of structuren te bepalen, omdat pathogenen zich hebben ontwikkeld om centrale cellulaire processen te onderdrukken als een strategie voor hun eigen overleving of voortplanting. Visualisatie van cellulaire componenten kan worden bereikt door recombinant fluorescent gelabelde gastheer eiwitten uit te drukken. Terwijl dit een real-time analyse mogelijk maakt, is de opwekking van cellijnen met specifiek gelabelde gastheerproteïnen zeer moeizaam en kan resulteren in ongewenste bijwerkingen. Handiger is de detectie van cellulaire factoren met behulp van specifieke antilichamen, omdat meerdere gastheerfactoren gelijktijdig kunnen worden geanalyseerd en men niet beperkt is tot een bepaald celtype. Een nadeel is dat alleen een statische weergave kan worden vastgelegd, aangezien immunofluorescentie analyse een gastheercelfixaat vereistion. Echter, een belangrijk voordeel van immunofluorescentie beeldvorming is dat het gemakkelijk leent op zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyse. Dit kan op zijn beurt gebruikt worden om statistisch significante verschillen te verkrijgen om nieuwe inzichten te geven in gastropathogene interacties.
Fluorescerende beeldanalyseprogramma's zijn krachtige analytische instrumenten voor het uitvoeren van 3D en 4D analyse. Echter, de hoge kosten van software en het onderhoud ervan maken methodes op basis van gratis open source software meer aantrekkelijk. Zorgvuldige beeldanalyse met behulp van bioanalysesoftware is waardevol, aangezien het visuele analyse ondersteunt en bij het toewijzen van statistische betekenis het vertrouwen in de correctheid van een bepaald fenotype vergroot. Voorheen zijn SG's geanalyseerd met behulp van de gratis ImageJ software, die de handmatige identificatie van individuele SG's 4 vereist. Hier leveren we een protocol voor de inductie en analyse van cellulaire SG-vorming in het kader van bacTerreine infecties met behulp van de gratis open source bio-image analyse software ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). De bio-image analyse software heeft een ingebouwde spot detector programma dat zeer geschikt is voor SG analyse. Hiermee kunt u het geautomatiseerde detectieproces verfijnen in bepaalde regio's van belangstelling (ROI's). Dit overwint de behoefte aan handmatige analyse van individuele SG's en verwijdert de steekproef.
Veel milieuprestaties veroorzaken de vorming van SG's, die fase-dichte cytosolische, niet-membranale structuren zijn van 0,2 – 5 μm in diameter 5 , 6 . Deze cellulaire respons wordt evolutionair geconserveerd in gisten, planten en zoogdieren en komt voor wanneer de mondiale eiwitvertaling wordt geremd. Het omvat aggregatie van vertaalde translatie-initiatiecomplexen in SG's, die beschouwd worden als houdplaatsen voor translationally-inactieve mRNA's, waardoor selectieve translatie van een subset van cellulaire mRNA's mogelijk is.Bij het verwijderen van de stress ontbinden SG's en de globale percentages van eiwitsynthese hervatten. SG's zijn samengesteld uit translatieverlengingsinitiatiefactoren, eiwitten die betrokken zijn bij RNA-metabolisme, RNA-bindende eiwitten, alsmede steigerproteïnen en factoren die betrokken zijn bij gastensignaalvorming 2 , hoewel de exacte samenstelling kan variëren afhankelijk van de toegepaste stress. Omgevingsfactoren die SG-vorming induceren omvatten onder meer aminozuurhongering, UV-bestraling, warmtechok, osmotische shock, endoplasmatische reticulumspanning, hypoxie en virale infectie 2 , 7 , 8 . Er is veel vooruitgang geboekt om te begrijpen hoe virussen induceren en ook SG-vorming onderdrukken, terwijl nog weinig bekend is over hoe andere pathogenen, zoals bacteriële, schimmel- of protozoa pathogenen, deze cellulaire stressrespons 1 , 7 beïnvloeden.
ShigeLla flexneri is een gram-negatief facultatief cytosolisch pathogeen van mensen en het veroorzakende middel van ernstige diarree of shigellose. Shigellose is een belangrijke publieke gezondheidsbelasting en leidt jaarlijks naar 28.000 sterfgevallen bij kinderen jonger dan 9 jaar. S. flexneri infecteert het colonepithelium en verspreidt cel-naar-cel door de gastheer's cytoskeletale componenten 11 , 12 te kapen. Infectie van het epitheel ondersteunt de replicatie van S. flexneri in het cytosol, maar geïnfecteerde macrofagen sterven door een ontstekingscel-doodsproces genaamd pyroptose. Infectie leidt tot een massale werving van neutrofielen en ernstige ontsteking die gepaard gaan met hitte, oxidatieve stress en weefselvernietiging. Aldus, terwijl geïnfecteerde cellen onderworpen zijn aan interne spanningen geïnduceerd door infectie, zoals Golgi-ontwrichting, genotoxische stress en cytoskeletale omrangS, geïnfecteerde cellen worden ook onderhevig aan milieuprestaties door het ontstekingsproces.
Karakterisering van het effect van S. flexneri- infectie op het vermogen van cellen om te reageren op milieupressen met behulp van een aantal SG markers heeft aangetoond dat infectie leidt tot kwalitatieve en kwantitatieve verschillen in SG-samenstelling 3 . Er is echter weinig bekend over andere bacteriële pathogenen. Hier beschrijven we een methode voor de infectie van gastheercellen met het cytosolische pathogeen S. flexneri , de stress van cellen met verschillende milieuprestaties, de etikettering van SG componenten en de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van SG-vorming en samenstelling in het kader van besmette En niet-geïnfecteerde cellen. Deze methode is op grote schaal van toepassing op andere bacteriële pathogenen. Daarnaast kan de beeldanalyse van de SG-vorming gebruikt worden voor infecties door virussen of andere pathogenen. Het kan gebruikt worden om SG te analyserenVorming bij infectie of het effect van infectie op SG-vorming in reactie op exogene stressen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier beschreven protocol beschrijft de inductie, lokalisatie en analyse van SG's in niet geïnfecteerde cellen en cellen geïnfecteerd met het cytosolische pathogeen S. flexneri in de aanwezigheid of afwezigheid van exogene stress. Met behulp van gratis beeldvormingssoftware kunnen de protocollen de precieze kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de SG-vorming identificeren en statistisch adresseren van verschillen in gegeven fenotypen.
Er zijn verschillende kritische sta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PS is een ontvanger van de Bill en Melinda Gates Grand Challenge Grant OPP1141322. PV werd ondersteund door een Zwitserse National Science Foundation Early Postdoc Mobiliteitsgemeenschap en een postdoctorale gemeenschap Roux-Cantarini. PJS wordt ondersteund door een HHMI-subsidie en ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.
Materials
| Primary Antibodies | |||
| eIF3b (N20), origin goat | Santa Cruz | sc-16377 | Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1 in 300 |
| eIF3b (A20), origin goat | Santa Cruz | sc-16378 | Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1 in 300 |
| eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal) | Cell Signaling | 3411 | Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1 in 800 |
| eIF4AI, origin goat | Santa Cruz | sc-14211 | Recommended by (Ref # 13). Dilution 1 in 200 |
| eIF4B, origin rabbit | Abcam | ab186856 | Good stress granule marker in our hands. Dilution 1 in 300 |
| eIF4B, origin rabbit | Cell Signaling | 3592 | Recommended by Ref # 13. Dilution 1 in 100 |
| eIF4G, origin rabbit | Santa Cruz | sc-11373 | Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1 in 300 |
| G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal) | BD Biosciences | 611126 | Widely used SG marker. Dilution 1 in 300 |
| Tia-1, origin goat | Santa Cruz | sc-1751 | Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1 in 300 |
| Alexa-conjugated Secondary Antibodies | |||
| A488 anti-goat , origin donkey | Thermo Fisher | A-11055 | Cross absorbed. Dilution 1 in 500 |
| A568 anti-goat, origin donkey | Thermo Fisher | A-11057 | Cross absorbed. Dilution 1 in 500 |
| A488 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A-21202 | Dilution 1 in 500 |
| A568 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A10037 | Dilution 1 in 500 |
| A647 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A31571 | Dilution 1 in 500 |
| A488 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A-21206 | Dilution 1 in 500 |
| A568 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A10042 | Dilution 1 in 500 |
| Other Reagents | |||
| Shigella flexneri | Available from various laboratories by request | ||
| Tryptone Casein Soya (TCS) broth | BD Biosciences | 211825 | Standard growth medium for Shigella, application – bacterial growth |
| TCS agar | BD Biosciences | 236950 | Standard growth agar for Shigella, application – bacterial growth |
| Congo red | SERVA Electrophoresis GmbH | 27215.01 | Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application – bacterial growth |
| Poly L lysine | Sigma-Aldrich | P1274 | Useful to coating bacteria to increase infection, application – infection |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application – infection |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | PH buffer useful when cells are incubated at room-temperature, application – cell culture |
| DMEM | Life Technologies | 31885 | Standard culture medium for HeLa cells, application – cell culture |
| Fetal calf serum | Biowest | S1810-100 | 5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application – cell culture |
| Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | 1/100 dilution used for HeLa cell culture medium, application – cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Reagent diluent, application – cell culture |
| Sodium arsenite | Sigma-Aldrich | S7400 | Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application – stress inducer |
| Clotrimazole | Sigma-Aldrich | C6019 | Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application – stress inducer |
| PFA | Electron Microscopy Scences | 15714 | 4% PFA is used for standard fixation of cells, application – fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application – permeabilization |
| A647-phalloidin | Thermo Fisher | A22287 | Dilution is at 1/40, best added during 2ary antibody staining, application – staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application – staining |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | BR701501 | Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application – staining |
| Prolong Gold | Thermo Fisher | 36930 | Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application – mounting |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting |
| 24-well cell culture plate | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Standard tissue culture plates, application – cell culture |
| 12-mm glass coverslips | NeuVitro | 1001/12 | Cell culture support for immunofluorescent applications, application – cell support |
| forceps | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and obust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting |
| Programs and Equipment | |||
| Prism | GraphPad Software | Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application – data analysis | |
| Leica SP5 | Leica Microsystems | Confocal microsope, application – image acquisition | |
| Imaris | Bitplane | Professional image analysis program, application – data analysis | |
| Excel | Microsoft | Data analysis and graphing program, application – data analysis | |
References
- Reineke, L. C., Lloyd, R. E. Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection. Virology. 436 (2), 255-267 (2013).
- Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase. Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).
- Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -. X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation. Cell Microbiol. 18 (7), 982-997 (2016).
- Kolobova, E., Efimov, A., et al. Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules. Exp Cell Res. 315 (3), 542-555 (2009).
- Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in biochemical sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
- Anderson, P., Kedersha, N. Stressful initiations. J Cell Sci. 115, 3227-3234 (2002).
- Mohr, I., Sonenberg, N. Host translation at the nexus of infection and immunity. Cell Host Microbe. 12 (4), 470-483 (2012).
- Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor. Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298 (4), 481-492 (2010).
- Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
- Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children. PloS One. 8 (9), 72788 (2013).
- Ashida, H., Ogawa, M., et al. Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses. Curr Opin Microbiol. 14 (1), 16-23 (2011).
- Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23 (4), 448-455 (2011).
- Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
- Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nat Re. Micro. 7 (5), 333-340 (2009).
