Inyección de raíz dorsal ganglio de raíz dorsal y Lesión por aplastamiento como modelo para la regeneración del axón sensorial
Summary
This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.
Abstract
Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.
Introduction
El logro de la regeneración axonal después de una lesión del sistema nervioso es una tarea difícil 1. Para estudiar el fracaso de la regeneración axonal en el sistema nervioso central (SNC), los investigadores han utilizado una gran cantidad de modelos de lesión del nervio. Como regiones del SNC difieren, es importante utilizar un modelo anatómicamente apropiado para estudiar la regeneración de axones. Al utilizar el modelo apropiado, los investigadores pueden formular un tratamiento específico basado en la gravedad de la lesión, el tipo de célula neuronal de interés, y el tracto espinal deseada para la evaluación de la regeneración, en contraposición a una estrategia de tratamiento "uno para todos".
En la lesión de la médula espinal, por ejemplo, los síntomas más debilitantes derivan de la pérdida de la sensibilidad y la locomoción. La pérdida de sensibilidad es causada por el daño a las vías sensoriales ascendentes, mientras que la pérdida de la locomoción es causada por el daño a las vías motoras descendentes. Debido a las diferencias anatómicas entre celulares y éstos two vías, muchos estudios de regeneración de los axones dirigidos sólo se centran en una u otra vía, con el argumento de que la recuperación exitosa de cualquiera sería de gran beneficio para los pacientes. En este artículo, se presenta un protocolo que utiliza una inyección directa de ganglios de la raíz dorsal (DRG) con un vector viral y una lesión por aplastamiento de la raíz dorsal concurrente en la médula espinal cervical inferior de una rata adulta como un modelo para estudiar la regeneración axonal sensorial.
DRG neuronas sensoriales son responsables de la transmisión de información sensorial, como la sensación táctil y el dolor, desde la periferia hacia el sistema nervioso central. Las largas proyecciones axonales de las neuronas sensoriales en la médula espinal sirven como un buen modelo para estudiar a larga distancia la regeneración axonal. Además, como los roedores pueden sobrevivir a una lesión vía sensorial tal como una lesión por aplastamiento de la raíz dorsal con complicaciones mínimas de bienestar, los investigadores pueden estudiar CNS regeneración axonal sin la necesidad de lesionar completamente la médula espinal. A C5 cuádruple – C8 (l cervicalevel 5 – 8) dorsal lesión por aplastamiento raíz se ha demostrado ser un modelo útil para pata deaferentación 2. Además, una lesión por aplastamiento de la raíz dorsal proporciona un modelo "más limpia" para estudiar la regeneración axonal de una lesión de la médula espinal directa, ya que no es complicado por otros factores tales como la formación de cicatriz glial.
El uso de la terapia génica viral para reprogramar las neuronas en un estado regenerativo ha sido considerado cada vez más como una estrategia prometedora para el tratamiento de muchos trastornos neurológicos 3. Los estudios han demostrado la aplicación de un vector de virus adeno-asociado (AAV) que lleva el transgén de una proteína promotora del crecimiento puede lograr robusto regeneración axonal con recuperación conductual 4, 5, 6. La aparente baja patogenicidad de AAV en provocar una respuesta inmune y la capacidad de transducir células que no se dividen, tales como neuronas, hacenque el vector óptimo para la terapia génica. Además, la forma de AAV recombinante se utiliza para la terapia. En esta forma, es incapaz de integrar su genoma viral en el genoma huésped 7, reduciendo el riesgo de mutagénesis de inserción en comparación con otros vectores virales, tales como lentivirus. Esto hace que el AAV una opción segura para aplicaciones de terapia génica.
Como DRG contiene los cuerpos celulares de las neuronas sensoriales, es el objetivo anatómico más apropiado para la administración de virus para la terapia génica para estudiar y / o promover la regeneración axonal sensorial. En un estudio comparativo de diferentes serotipos de AAV y lentivirus, AAV de serotipo 5 (AAV5) ha demostrado ser el más eficiente en la transducción de las neuronas DRG más de un curso de tiempo de al menos 12 semanas cuando se inyecta directamente en el DRG 8. Además, AAV puede lograr la eficiencia de transducción de más del 40%, la transducción de todos los subtipos neuronales DRG, como el neurofilamento de gran diámetro 200 kDa(NF200) neuronas positivas y el péptido relacionado con el gen de la calcitonina de pequeño diámetro (CGRP) – o b4 isolectina (IB4), las neuronas positivas 4, 8.
A medida que el procedimiento quirúrgico de la inyección de DRG y la lesión por aplastamiento de la raíz dorsal es muy invasivo y delicada, creemos que este artículo va a ayudar a los nuevos usuarios a aprender el procedimiento de una manera muy eficiente. En este artículo, se muestra resultados representativos de ratas adultas cuatro semanas después de la inyección de un virus de control AAV5-GFP (proteína fluorescente verde) en C6 – GRD C7 con un C5 concurrente – C8 de la raíz dorsal lesión por aplastamiento. Este modelo es especialmente adecuado para los investigadores que investigan el uso de la terapia génica viral para promover la regeneración axonal sensorial.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo, se presentan una guía paso a paso para llevar a cabo una inyección de DRG y la lesión por aplastamiento de la raíz dorsal de la médula espinal cervical inferior de una rata adulta. Como se trata de una cirugía muy invasiva y delicado, se recomienda encarecidamente que todos los usuarios potenciales obtengan la suficiente formación y la práctica antes de avanzar a vivir la cirugía animal. Los usuarios deben estar familiarizados no sólo con la anatomía de la médula espinal, pero también con…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas del Centro de Investigación Biomédica de Cambridge NHMRC Fundación Christopher y Dana Reeve, el Consejo de Investigación Médica, el Consejo de Investigación ECMneuro Europea, y. Nos gustaría expresar nuestro más profundo agradecimiento a Heleen Merel van 't Spijker y Justyna Barratt por su asistencia técnica durante el rodaje. Nos gustaría agradecer a la doctora Elizabeth Moloney y Profesor Joost Verhaagen (Instituto Holandés de Neurociencia) para ayudar en la producción de AAV.
Materials
| Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1% |
| Cholera Toxin B subunit | List Biological Laboratories | 104 | For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1% |
| IsoFlo | Zoetis | 115095 | Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane) |
| Baytril 2.5% injectable | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg |
| Carprieve 5.0% w/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg |
| Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Eye ointment |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
| Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7mm Cup | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
| Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | For performing dorsal root crush injury |
| Tissue Separating Scissors | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
| Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
| Vannas Spring Scissors (straight) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972 | For bleeding control |
| Microliter Syringe RN701 (10 μl) | Hamilton | 80330 | |
| Custom-made Removable Needle (for DRG injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
| Custom-made Removable Needle (for CTB injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, point style 3 |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |
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