WinCF 모델 - 폐렴의 미생물학을 연구하기 위해 점액으로 촘촘하게 밀집된 Bronchiole의 저렴하고 견고한 소우주
Summary
점액은 낭포 성 섬유증의기도가 (CF) 환자는 미생물 병원균이 번창 할 수있는 이상적인 환경이다 연결. 원고들은 화학 조건의 질병 및 방법 변경의 원인이 모방 미생물 역학을 구동 할 수있는 환경에서 CF 폐 마이크로 바이 옴을 연구하기위한 새로운 방법을 설명합니다.
Abstract
많은 만성기도 질환으로 인해 점액이 막히게됩니다. 낭포 성 섬유증을 앓고있는 개인의 폐는 점막이 막힌 세기관지가 미생물의 식민지화에 유리한 서식처를 만드는 대표적인 사례입니다. 이 환경에서 서로간에 상호 작용하며 CF 질환과 관련된 많은 증상을 유발하는 다양한 병원체가 번창합니다. 미생물 군집과 마찬가지로, 서식지의 화학적 조건은 지역 사회 구조와 역 동성에 중요한 영향을 미친다. 예를 들어, 서로 다른 미생물은 서로 다른 수준의 산소 또는 다른 용질 농도로 번성합니다. 이는 산소 농도가 지역 사회의 생리 및 구조를 유도하는 것으로 여겨지는 CF 폐에서도 마찬가지입니다. 여기에 설명 된 방법은 폐 환경을 모방하고 질병을 유발하는 것과 유사한 방식으로 병원균을 성장 시키도록 고안되었습니다. 이러한 미생물의 화학적 환경에 대한 조작은 화학 물질폐 감염의 stry는 미생물의 생태를 제어합니다. 상기 방법은 시스템 WinCF 불리는 인공 타액 매체 및 기관지 점액 플러그에 존재하는 것과 유사한 산소 구배를 제공하기위한 좁은 모세관에 기초한다. 이러한 객담 항생제 압력 매체의 pH와 같은 화학적 조건을 조작하는 것과 샘플의 미생물의 차이, 컬러 표시를 이용하여 가스 또는 바이오 필름 제조 시청하거나 추출하고, 각 샘플의 핵산 함량 시퀀싱의 시각화를 허용한다.
Introduction
이 논문에 기재된 방법은 WinCF 시스템 (1)라고한다. WinCF의 전반적인 목표는 점액 가득 찬 폐의 세기관지의 환경을 시뮬레이션 할 수있는 실험 장치를 제공하는 것입니다. 다루기 쉬운 시스템은 낭포 성 섬유증 (CF), 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 천식 등을 포함한 점액 과분비 표현형과 폐 질환의 미생물 병원체를 연구하기 위해이 허용됩니다. 절차는 폐 분비물이 결국 점액 2 세기관지 및 다른 작은 통로를 작성, 삭제하는 두꺼운 하드되는 원인 돌연변이에 의해 특징 CF의 연구를 위해 특별히 설계되었습니다. 흡입 공기가 더 이상 많은 폐포에 도달하고 또한 세균성 식민지 3, 4의 서식지를 제공 할 수 있기 때문에 폐에서 이러한 방해는 가스 교환을 억제하지 않습니다. 무능력은 미생물의 성장을 방지하기 위해과도한 폐 점액은 결국기도의 복잡한 만성 감염의 발달로 이어진다. 이 공동체에는 바이러스, 균류 및 녹농균 과 같은 박테리아를 비롯한 다양한 유기체가 포함되어 있으며 모두 서로 상호 작용합니다 ( 5 , 6 , 7 , 8) . CF 폐 Microbiome의 활동은 폐 악화 1 , 9 , 10 , 11 이라고 불리는 증상의 발적과 관련이 있다고 여겨집니다. WinCF는 이러한 악화 주변의 미생물 군 행동에 대한 연구를 가능하게하고 현재는 폐 미생물 생태학을 연구하기위한 기본 실험 시스템으로 확장되고 있습니다. 전통적으로 악화는 폐에서 채취 한 표본을 직접 분석하여 연구되었습니다. 많은 교란 요인이 미생물 b의 직접 분석을합니다.WinCF 시스템을 사용하여 폐에 생기가 생기면 이러한 많은 요인들이 제거되고 폐 Microbiome의 행동을보다 직접적으로 연구 할 수있어 점액이 막힌 기관지 내 박테리아 활동을보다 세밀하게 분석 할 수 있습니다.
WinCF 시스템은 효과적으로 폐 환경을 모방하는 방식으로 박테리아를 증식 및 분석하는 방법을 제공합니다. 폐 박테리아를 재배하기위한 전통적인 방법은 종종 전통적인 한천 접시에서 표본을 배양하는 것과 관련이 있습니다. 이 방법은 샘플을 대기 중의 산소로 개방하여 점액 12 , 13로 막힌 폐 기관지에서 발견되는 저산소 상태 및 종종 무산소 상태를 설명하지 않습니다. 호기성 조건에서 한천 배양은 CF 폐의 환경과 아무런 상관이 없으며 치료하려고하는 병원체의 행동과 관련하여 임상의와 연구원을 오도 할 수 있습니다. 또한, 한천 플레이트의 박테리아가 이용할 수있는 영양물인공 가래 매체 (ASM)를 이용하여 WinCF에서 차지하는 실제 가래에서 사용 가능한 것과는 다른 것입니다. Sriramulu et al. 의 Pseudomonas 배양 물에 나타난 것처럼 . 14 에서 ASM은 가래에 사용할 수있는 자원을 모방하고 객담의 물리적 일관성을 복제하는 특정 구성 요소 세트를 포함합니다. 질병이있는 폐에는 특정 미생물이 있기 때문에 이러한 미생물에 대한 연구는 이상적으로 폐의 특정 조건에서도 이루어져야합니다.
WinCF 시스템은 실험 조건을 신속하게 분석하고 조작하여 실제 폐 기관지에서 발생하는 것과 유사한 미생물 변화를 관찰 할 수 있습니다. 이 기술은 객담, 타액, 다른 체액 분비물 및 순수 또는 혼합 세균 배양과 같은 무수한 관련 표본 유형의 접종을 허용합니다. 실험 설정의 본질은 다음을 즉시 시각적으로 해석 할 수 있습니다.미생물 군집 행동과 미생물 및 오 믹스 절차의 다수의 쉬운 하위 응용 프로그램을 가능하게하도록 설계되었습니다. 이러한 연구는 세균 공동체 구성이 환경의 물리 화학적 조건에 따라 달라지기 때문에 중요합니다. WinCF를 사용하면 배지의 화학적 조건을 조작하여 세균 활동에 미치는 영향을 분석 할 수 있습니다. 예를 들어, 시료의 접종 전에 배지의 산도를 변경할 수 있습니다. 배양 후, 이들 각각의 조건에서 박테리아 활성을 직접 비교할 수 있으며, 그 가래 샘플의 박테리아가 다양한 pH에 반응하여 어떻게 행동하는지에 대한 결론을 도출 할 수 있습니다. 여기에서는 WinCF 시스템을 적용하는 절차와 폐 화학 미생물에 미치는 영향을 연구하기 위해 매개 화학이 어떻게 조작 될 수 있는지에 대한 예를 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
CF와 폐의 미생물 메이크업은 생물의 큰 다양성을 포함하고 있지만, 폐 내의 조건은 가능성이 미생물의 종류가 생존하고, 13 15 번성 할 수 있는지에 상당한 영향을 미친다. 특정 메커니즘을 통해 이러한 조건을 변경하고 그들이 폐 마이크로 바이에 미치는 정확한 영향은 현재 일반적으로 불분명하다. 이 실험에있어서, 우리는 시뮬레이션 된 폐 세기관지…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 자금 보조금 1 U01 AI124316-01, 다제 내성 병원균의 치료에 시스템 생물학 접근 R 퀸과 NIH / NIAID 자금을 지원하기위한 버텍스 제약과 낭포 성 섬유증 연구 혁신 상을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한이 작품의 엔지니어링 측면과 협력을 촉진하기위한 UCSD의 학부 기계 공학 수석 설계 과정에서 기계 항공 공학부에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Color-Coded Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-260943 | |
| Cha-seal Tube Sealing Compound | Kimble-Chase | 43510 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma | M1778 | |
| Ferritin, cationized from horse spleen | Sigma | F7879 | |
| Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified) | AppliChem Panreac | A2159 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning cellgro | 25-025-CI | |
| MEM Amino Acids | Cellgro | 25-030-CI | |
| Egg Yolk Emulsion, 50% | Dalynn Biologicals | VE30-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P2157500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271500 | |
| 15mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-666 | |
| 50mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-656 | |
| 1.5mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-150-R | |
| 2.0mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-200-C |
References
- Quinn, R. A., et al. A Winogradsky-based culture system shows an association between microbial fermentation and cystic fibrosis exacerbation. ISME J . 9, 1024-1038 (2015).
- Quinton, P. M. Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis. Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).
- Harrison, F. Microbial ecology of the cystic fibrosis lung. Microbiology. 153 (Pt 4), 917-923 (2007).
- Caverly, L. J., Zhao, J., LiPuma, J. J. Cystic fibrosis lung microbiome: Opportunities to reconsider management of airway infection. Pediatr pulmonol. 50, S31-S38 (2015).
- Blainey, P. C., Milla, C. E., Cornfield, D. N., Quake, S. R. Quantitative analysis of the human airway microbial ecology reveals a pervasive signature for cystic fibrosis. Sci Transl Med. 4 (153), 153ra130 (2012).
- Willner, D., et al. Spatial distribution of microbial communities in the cystic fibrosis lung. ISME J. 6 (2), 471-474 (2012).
- Delhaes, L., et al. The airway microbiota in cystic fibrosis: a complex fungal and bacterial community–implications for therapeutic management. PloS one. 7 (4), e36313 (2012).
- Rogers, G. B., et al. D. Bacterial diversity in cases of lung infection in cystic fibrosis patients: 16S ribosomal DNA (rDNA) length heterogeneity PCR and 16S rDNA terminal restriction fragment length polymorphism profiling. J clin microbiol. 41 (8), 3548-3558 (2003).
- Stenbit, A. E., Flume, P. A. Pulmonary exacerbations in cystic fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 17 (6), 442-447 (2011).
- Twomey, K. B., et al. Microbiota and metabolite profiling reveal specific alterations in bacterial community structure and environment in the cystic fibrosis airway during exacerbation. PloS one. 8 (12), e82432 (2013).
- Carmody, L. A., et al. Changes in cystic fibrosis airway microbiota at pulmonary exacerbation. Ann. Am. Thorac. Soc. 10 (3), 179-187 (2013).
- Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. J. Clin. Invest. 109 (3), 317-325 (2002).
- Cowley, E. S., Kopf, S. H., LaRiviere, A., Ziebis, W., Newman, D. K. Pediatric Cystic Fibrosis Sputum Can Be Chemically Dynamic, Anoxic, and Extremely Reduced Due to Hydrogen Sulfide Formation. mBio. 6 (4), e00767-e00715 (2015).
- Sriramulu, D. D., Lünsdorf, H., Lam, J. S., Römling, U. Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung. J. Med. Microbiol. 54 (Pt 7), 667-676 (2005).
- Quinn, R. A., et al. Biogeochemical forces shape the composition and physiology of polymicrobial communities in the cystic fibrosis lung. mBio. 5 (2), (2014).
