体外と体内の T, B, 骨髄細胞の抑制活性と移植から体液性応答の評価
Summary
ここでは、受信者からの明瞭な細胞のサブセットの抑制能力と受信者ドナーまたは外因性の抗原への免疫の状態、移植、耐性を誘導し、 in vitroとin vivo評価プロトコルを提案します。
Abstract
移植の主な関心事は、細胞の誘導を介して特定のトレランスを達成するためにです。トレランスのメカニズムの理解には、信頼性の高いモデルが必要です。ここでは、共刺激が引き起こす信号の封鎖すること遺伝子導入による免疫制御分子の発現によって誘導されるラットの心臓移植への耐性のモデルについて述べる。これらの各モデルは、制御性 T 細胞 (Treg)、B 細胞 (Bregs) や骨髄性細胞 (RegMCs) など細胞の生体内で生成できます。本稿で述べる特定し、寛容誘導と保守.に彼らの責任を決定するための in vitroとin vivoの規制細胞活性の定義に使用されている 2 つの相補的なプロトコルまず、体外抑制アッセイは用量依存的にエフェクター免疫応答の抑制能力を持つ細胞の迅速な同定を可能し、サイトカイン測定や細胞毒性などさらに分析に使用することができます。第二に、新しく照射接木された受信者に寛容な扱われた受信者からセルの養子転送監督移植免疫反応を制御するおよび/または新しい細胞 (の変換でこれらの細胞性免疫寛容を強調表示呼ばれる感染性トレランス)。これらのメソッドは、表現型の既知のマーカーとセルに制限されておらず、任意のセル人口を拡張することができます。さらに、ドナー監督 allospecificity 細胞 (フィールドで重要な目標) の第三者によるドナーの細胞を使用して評価することができますまたは体外か体内に移植します。最後に、これらの細胞の特定の免疫寛容の容量を調べるには、体液性抗ドナー抗体と受信者の新しいまたは元の知られている抗原に対する体液性応答を開発する能力を評価するためのプロトコルを提供します。説明耐性のモデルはさらに新しいバイオ マーカーと免疫制御分子を識別するために細胞を特徴付けるために使用ことができます、他の移植モデルまたは齧歯動物または人間の自己免疫疾患に適応。
Introduction
ラット心臓移植寛容誘導とメンテナンスのメカニズムを解読するためのトレランス誘導治療を評価するために信頼性の高い臓器移植モデルで、機能的有能で支配的な細胞を誘発する可能性があります。以下のプロトコルは、ルイス 1 a 受信者ラット (LEW.1A、RT1、) に、完全に不一致異所性心臓移植ルイス 1 w ドナー ラット (LEW.1W、RT1u) をについて説明します。この台木に急性拒絶反応は急速に (約 7 日間) で発生して簡単に測定、腹部の触診を破って移植によって評価されることができます。ここでラットの心臓移植への耐性を誘導するために 3 つのプロトコルを提案する.これらのモデルで耐性誘導や各種規制のセルによって維持されます。最初に、CD40Ig をエンコード アデノ ウイルスと CD40 CD40L の相互作用のブロック (AdCD40Ig) による CD8 の世代二次グラフト受信者1に転送+ Treg ときに対して耐性を誘導することができます。さらに、による cd8 陽性+細胞 (抗 CD8α 抗体) に生成 AdCD40Ig 扱われる受信者 Bregs と RegMCs の2。CD8 の深い分析+ Treg プロパティは、インターロイキン-34 (IL-34)、Fibroleukin 2 (FGL-2)3,4,5,6 として定義されているいくつかの免疫調節分子の重要な役割を強調表示.(AAV ベクター) と IL-34 の過剰発現は、RegMCs の世代を通じて自己寛容を誘導に対し FGL 2 の過剰発現は細胞の複雑なネットワークを基になる Bregs を誘発しました。
慢性拒絶反応はゆっくり開発し、長期、慢性拒絶反応に対する許容範囲を区別するために詳細な分析が必要です。移植は通常細胞浸潤の評価 immunohistology7による血管壁と補完 C4d 沈着の肥厚、線維化。組織学方法、動物の犠牲を必要とするまたは生検を移植、ここで忍容性同種のさまざまな機能を評価する簡単な方法を説明: 出現および細胞と血液から抗ドナー抗体応答の機能フローサイトメトリーによるサンプル (ここでは、我々 は蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えを使用)。
公差、同種移植を治療の逮捕後のメンテナンスは8細胞の誘導と一般に関連付けられました。最後の十年の研究は、CD4 に焦点を当てた+Treg 満場一致で特徴と+キー マーカー Foxp3 によってそれら、CD25高CD127–9,10,11。同様に、いくつかのマーカーは、CD8 に帰因した+ Treg CD122 よう+、CD28–、CD45RC低、PD1+とヘリオス+1、12,13,14,15,16,17. 年、GITR、CTLA4、およびサイトカインの発現 (IL-10、TGFβ、イリノイ州 34、IL 35、FGL-2) Treg プロファイル3,4,6,13にさらに関連付けられました。 18,19,20,21。Bregs、RegMCs、NKTregs などの新たな規制のセル人口は、関連性の高い特定のマーカーを欠けています。確かに、Bregs は大抵未熟な CD24 として報告されますあいまいな CD27 の発現と時々 IL-10、TGFβ、またはグランザイム B22,23,24の生産、+の細胞します。骨髄性細胞系列の複雑さには、CD14、CD16、CD80、CD86、CD40、CD209a、または CD163 の25,26などの規制や炎症性のプロファイルを定義するいくつかのマーカーの組み合わせが必要です。最後に、いくつかのマーカーは、CD11b など NKTregs を識別するために報告されている+CD27+表現型を記述するために27,28,29 TGFβ+、しかしより多くの研究が必要 ,30,31,32。したがって、抑制活性の証拠はさらに新しいバイオ マーカーの同定については表現型を正当化するために必要な新しい免疫メディエーターと新しい細胞療法に範囲を拡張します。
細胞の抑制活性を評価する 2 つの補完的な手法を提案する.まず、体外法ドナー抗原提示細胞 (APCs) 異なる比率で 6 日間で刺激したラベル付きエフェクター T 細胞の抑制細胞を培養で構成され、分析、エフェクター T 細胞の増殖をドナー監督免疫抑制を反映しています。投与したラットからの細胞は素朴なラットおよび非投与移植ラット抑制活性のため (またはその他の規制のセル人口) から抑制: エフェクターの比率の範囲内のセルに直接比較できます。また、このメソッドは、すべての移植を必要としない、6 日以内に結果が得られます。第二に、体内のメソッドは、目的の細胞を投与群のラットから新しく照射移植の受信者に転送するで構成されます。B 細胞、骨髄細胞、T 細胞から世間知らずの非投与ラット、養子の転送時にグラフト生存を延長する、急性拒絶反応を抑制することができる通常、扱われる受信者から増強作用抑制活性を持つ細胞があるこれらの属性1,2,3,4,33。受信者の照射によるリンパ球減少症に対して転送細胞血液の恒常性によって影響を受けませんし、抗ドナー免疫反応をより簡単にマスターできるように推奨します。両方の方法は、同種造血幹細胞の in vitro利用第三者 Apc または生体内で養子伝達抑制のためサードパーティ心移植の受信者に細胞は抗ドナー特異性の解析を許可します。体内法表現悪い細胞のかなりの数を必要とするのに対し、細胞の亜集団は抑制活性の in vitro33より簡単に評価できます。
体液性応答は、寛容の状態、ドナー抗原に対する抗体の監督のコントロールを評価するためにも測定できます。確かに、寛容は、ドナーに対する体液性応答の不在が、受信者が新しい抗原に対する体液性応答を開発するための能力の保全と記憶応答の保全によって特徴付けられます。まず、alloantibody 検出の原理は、移植の受信者から次のドナー細胞血清型のインキュベーション受信者抗体によるドナー細胞の認識に基づいています。外因性の抗原に対する 2 番目、体液性応答は、長期許容受信者鍵穴カサガイ ヘモシアニン (KLH) が乳化フロイント完全アジュバントの評価次刺激をすることができます。抗原に対する特異 IgM および IgG 抗体の存在を検出できます 4 と 13 日、それぞれ、免疫、酵素リンク免疫測定法 (ELISA)34以下。第三に、移植と赤血球染色受信者血清日収集 +8 と移植 +17 日-7 と +3 で異種の赤い血球 (赤血球) の注射による免疫学的記憶の保存を評価できます。これらすべてのメソッドは、免疫グロブリンのサブタイプの同定、特定の二次抗体と FACS の汚損によって未満 1.5 h で結果の迅速な収集や elisa 法によるいくつかの時間を使用しています。
最後に、これらのプロトコルは移植モデルのために設計されて、ある程度、自己免疫疾患モデルに適用することができます。法の原則は、すべての種に置き換えることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
新しく移植の受信者へ合計脾細胞の養子送金する誘導または治療による細胞の存在を検出する効率的な方法です。ホスト照射誘起過渡のリンパ球減少は、転送後の細胞生存率と許容範囲の確立を推進しています。また、亜致死照射は免疫寛容免疫再構築、感染耐性34と呼ばれる現象の中に新しい細胞に変換するプロパティを持つセルの時間を残します。通常、よく説明 CD4<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ANR (ANR-11-LABX-0016-01)、IHU セスタス プロジェクトも、資金を管理する”Investissements d’Avenir”フランス政府プログラムの一部である Labex 囲碁プロジェクト (n ° ANR-11-LABX-0016-01) のコンテキストで実現した、”Investissements d’Avenir「フランス政府プログラム、管理によって、フランス国立研究機関 (ANR) (ANR-10-IBHU-005)。IHU セスタス プロジェクトはナントとペイ ・ ド ・ ラ ・ ロワール地方でもサポートされます。
Materials
| animals | |||
| LEW.1W and LEW.1A rats | Janvier Labs, France | 8 weeks old, | |
| BN third party donor rats | Janvier Labs, France | 8 weeks old, | |
| 姓名 | company | catalogue number | comments |
| reagents | |||
| AdCD40Ig | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
| IL34-AAV | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
| FGL2-AAV | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
| anti-TCR | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | R7/3 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD25 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX39 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD8 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX8 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD45RA | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX33 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD161 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | 3.2.3 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD11b/c | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX42 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-TCRgd | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | V65 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD45RC | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX22 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD4 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX35 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD45R | BD Biosciences, Mountain View, CA | #554881, His24 clone | |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA | #112-096-071 | |
| anti-rat IgG1 | Serotec | #MCA 194 | |
| anti-rat IgG2a | Serotec | #MCA 278 | |
| anti-rat IgG2b | Serotec | #MCA 195 | |
| anti-rat IgM-FITC | Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA | #115-095-164 | |
| streptavidin HRP | BD Biosciences, Mountain View, CA | #554066 | |
| KLH | Sigma Aldrich, St. Louis, USA | #9013-72-3 | |
| PBS 1X | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, | |
| Tween 20 | Sigma, Saint-Louis, USA | #9005-64-5 | |
| TMB substrate reagent kit | BD Biosciences, Mountain View, CA | #555214 | |
| CellTraceTM CFSE cell proliferation kit | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #C34554 | |
| RPMI 1640 medium 1X | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #31870-025 | |
| penicilline streptomycine | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #15140-122 | |
| Hepes Buffer | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #15630-056 | |
| non essential amino acids | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #11140-035 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #11360-039 | |
| 2 beta mercaptoethanol | Sigma, Saint-Louis, USA | #M3148 | |
| Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #65-0842-85 | |
| Glutamine | Sigma, Saint-Louis, USA | #G3126 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #D1306 | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics, Germany | #11088882001 | |
| EDTA | Sigma, Saint-Louis, USA | #E5134 | |
| NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | #B230561 | |
| Magnetic dynabeads | Dynal, Invitrogen | #11033 | Goat anti-mouse IgG |
| One Comp eBeads | Ebiosciences, San Diego, USA | #01-1111-42 | |
| Betadine | Refer to the institutional guidelines | ||
| Isoflurane | Refer to the institutional guidelines | ||
| Naplbuphine | Refer to the institutional guidelines | ||
| Terramycine | Refer to the institutional guidelines | ||
| Buprenorphine | Refer to the institutional guidelines | ||
| Meloxicam | Refer to the institutional guidelines | ||
| Complete Freund's adjuvant | |||
| Rompun | Refer to the institutional guidelines | ||
| Ringer lactate | Refer to the institutional guidelines | ||
| Ketamine | Refer to the institutional guidelines | ||
| Red blood cell lysis solution | Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O. | ||
| Collagenase D | Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS | ||
| PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%) | Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X | ||
| CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen) | Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution | ||
| complete medium for coculture | 500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS | ||
| 姓名 | company | catalog number | comments |
| equipments | |||
| falcon 50ml | BD Biosciences, Mountain View, CA | #227261 | |
| falcon 15ml | BD Biosciences, Mountain View, CA | #188271 | |
| sieve | |||
| Corning plastic culture dishes | VWR, Pessac | #391-0439 | |
| 100µm and 60µm tissue filters | Sefar NITEX, Heiden, Switzerland | #03-100/44 and #03-60/35 | |
| 96 wells U bottom plates for coculture | Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning | #353077 | |
| 96 wells V bottom plates for FACS staining | ThermoScientifique, Danemark | #249570 | |
| 96 wells flat bottom ELISA plates | Nunc Maxisorb | ||
| seringue for spleen crush | BD Biosciences, Mountain View, CA | #309649 | |
| ELISA reader | SPARK 10M, Tecan, Switzerland | SPARK 10M, Tecan, Switzerland | |
| centrifuge | |||
| bain marie | |||
| X rays irradiator | Lincolshire, England | Faxitron CP160 | |
| solar agitator | |||
| FACS Canto II | BD Biosciences, Mountain View, CA | ||
| FACS Aria II | BD Biosciences, Mountain View, CA | ||
| magnet | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | 12302D |
References
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