JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物学

Vet orgel cultuur lichaamssysteem in Aedes Aegypti, een Vector van Zika-Virus

Published: August 19, 2017
doi:
10.3791/55508
, , , , , , , ,
1Department of Biology,New Mexico State University, 2Department of Molecular Genetics and Microbiology,Duke University, 3Department of Computer Sciences,New Mexico State University, 4Department of Epidemiology of Microbial Diseases,Yale School of Public Health, 5Institute of Applied Biosciences,New Mexico State University

Summary

Het lichaam vet is het centrale metabole orgaan in insecten. Presenteren we een levende orgel cultuur systeem waarmee de gebruiker om te bestuderen van de antwoorden van geïsoleerde vet lichaamsweefsel op verschillende stimuli.

Abstract

Het insect vet lichaam speelt een centrale rol in insect metabolisme en nutriënten opslag, spiegeling van de functies van de lever en het vetweefsel in gewervelde dieren. Insect vet lichaamsweefsel is meestal verspreid over het insect lichaam. Het is echter vaak geconcentreerd in de buik en gekoppeld aan de buikwand van het lichaam.

De mug vet lichamelijk is de enige bron van de dooier-eiwitten, die kritisch zijn voor de eiproductie. Daarom de in vitro cultuur van mug vet lichaamsweefsels vertegenwoordigt een belangrijk systeem voor de studie van de mug fysiologie, metabolisme, en, uiteindelijk, de eiproductie. Het vet lichamelijk cultuur proces begint met de voorbereiding van oplossingen en reagentia, met inbegrip van stamoplossingen van aminozuur, Aedes fysiologische zoutoplossing zout stockoplossing (APS) en calcium stockoplossing vet lichamelijk kweekmedium. Het proces wordt voortgezet met vet lichamelijk dissectie, gevolgd door een experimentele behandeling. Na de behandeling, kan een verscheidenheid van verschillende analyses worden uitgevoerd, en RNA sequencing (RNA-Seq), qPCR, Western blots, proteomica, metabolomica.

In ons voorbeeld experiment tonen wij het protocol via de besnijdenis en de cultuur van vet organen van de gele koorts mug, Aedes aegypti, een voornaamste vector van arboviruses zoals dengue en chikungunya Zika. RNA van vet organen gekweekt onder een fysiologische aandoening bekend aan upregulate dooier-eiwitten ten opzichte van de controle waren onderworpen aan RNA-Seq analyse om aan te tonen van het potentiële nut van deze procedure voor onderzoek van de genexpressie.

Introduction

Muggen zijn vectoren van verwoestende ziekten bij de mens, met inbegrip van malaria, knokkelkoorts, chikungunya en Zika1,2,3. Ondanks intensieve internationale inspanningen om deze ziekten tegen te gaan en zo de besturing van de ziekte-overdracht mug populaties, zijn epidemische uitbraken van door muggen overgebrachte ziekten nog steeds gebruikelijk, vooral in ontwikkelingslanden. Effectieve vaccins tegen veel van deze ziekten zijn niet beschikbaar of van beperkte doeltreffendheid4,5. De meest effectieve manier om uitbraken te voorkomen is om controle van de mug populaties, voornamelijk door het gebruik van de insecticide behandelingen. Insecticide resistentie heeft echter ontwikkeld in vele mug populaties en uitgegroeid tot een gemeenschappelijk probleem rond de wereld6,7,8. De studie van de mug fysiologie is essentieel voor de ontwikkeling van nieuwe instrumenten en strategieën ter bestrijding van ziekte.

De mug vet lichamelijk speelt een centrale rol in nutriënten opslag, metabole homeostase, voortplanting en xenobiotische katabolisme9,10,11,12. Het is de belangrijkste opslagplaats orgaan voor triglyceriden, glycogeen en aminozuren in de vorm van opslag eiwitten. Het functioneert ook als de locatie van synthese voor de meeste Hemolymfe eiwitten en metabolieten. Muggen is het lichaam vet de enige bron van productie van de dooier-eiwitten dat zich bij vrouwtjes voordoet nadat zij een bloedmeel13,14.

De belangrijkste celtype van het lichaam vet is de grote, polyploïde trophocyte of adipocyte3,9,10,12. Vet lichaamsweefsel is ingedeeld in lobben of omhulsels en kan worden gevonden in alle lichaamsdelen van de mug, met het grootste deel ligt in de buik, waar grote lobben van vet lichamelijk zijn gekoppeld aan de buikwand van het lichaam.

De mug vet cultuur lichaamssysteem hier gepresenteerd werd ontwikkeld in de jaren ‘ 70 en een krachtig hulpmiddel voor de studie van vet lichamelijk fysiologie10, vooral in combinatie met de huidige analyse technologieën blijft. De Stichting van deze techniek is gebaseerd op het isolement van de abdominale lichaam muren en de bijbehorende vet lichaamsweefsel. Het hydrofoob karakter van de abdominale cuticle veroorzaakt te drijven op het oppervlak van de voedingsbodem, met de bijgevoegde kwabben van buik vet lichamelijk ondergedompeld. De spiracles en tracheolar structuur worden gehandhaafd, waarborgen van oxygenatie van de gekweekte weefsel. Voortaan zullen we verwijzen naar deze preparaten als “vet organen.” Geïsoleerde vet organen levensvatbaarheid voor meer dan 12 h wanneer geïncubeerd in het geschikte medium (niet-gepubliceerde resultaten). Vet lichamelijk cultuur is een waardevol instrument dat een aantal vragen met betrekking tot vet lichamelijk endocrinologie en fysiologie9,10,12,15,16, heeft aangepakt 17.

Gekweekte vet organen kan worden onderworpen aan verschillende experimentele en controle van de behandelingen, de timing waarvan kan worden vastgesteld door de onderzoeker. Aan het eind van de incubatietijd, kan de vet-organen worden verzameld en verwerkt voor downstream analyses, met inbegrip van de qPCR16,17,18,19, Western blotting18 ,20, proteomics21of metabolomica22. Experimenten kunnen worden uitgevoerd op verschillende schalen, van individuele vet organen tot groepen van honderden die samen kunnen worden gekweekt.

De representatieve resultaten opgenomen hier zijn afgeleid van vet organen gekweekt in aanwezigheid van aminozuren en de steroïde hormoon 20-hydroxy-ecdysone te simuleren de bloedmeel activering van vitellogenesis16,17, 23,24. We geanalyseerd en vergeleken de differentiële genexpressie van niet-geactiveerde versus geactiveerde vet organen via volgende-generatie sequentie-analyse.

Protocol

1. voorbereiding van de oplossingen en reagentia aminozuur stockoplossing voorbereiden een 4 X aminozuur stockoplossing 23 , 24 door weging en de 20 verschillende aminozuren toe te voegen aan een erlenmeyer volgens de concentraties die zijn gegeven in tabel 1. Opmerking: In sommige gevallen amino acid(s) kan worden uitgesloten van de oplossing en vervangen door gelijke molaire hoeveelheden mannitol om een gelijke concentratie van osmolytes. Toevoegen van de juiste hoeveelheid ddH 2 O te produceren van de gewenste hoeveelheid oplossing. Om ervoor te zorgen dat de aminozuren hebben volledig is opgelost, Verwarm zacht terwijl het voortdurend roeren totdat de vloeistof is volledig duidelijk; het duurt op een lichte gele tint. Opmerking: Het kan noodzakelijk zijn om de pH tot 6 door het toevoegen van HCl zodat sommige van de meer hydrofobe aminozuren te ontbinden zijn. Aliquot de oplossing en steriele-filter door middel van een spuit-filter met een 0,2-µm porie grootte. Op te slaan in een verzegelde container bij-20 ° C gedurende maximaal 6 maanden. APS Opmerking: Zie 25. Voor de 20 X zout stockoplossing, combineren de zouten die zijn vermeld in tabel 2 in 50 mL water. Roer tot het volledig is opgelost. Opmerking: Het wellicht iets Verwarm de oplossing volledig oplossen de zouten. Steriel-filter door middel van een spuit-filter met een 0,2-µm porie grootte en bewaar de oplossing in een tube van 50 mL bij -20 ° C. Calcium stockoplossing voor de 50 X calcium stockoplossing, 0.90 g van calciumchloride toevoegen aan 100 mL water (tabel 3), roer tot het volledig is opgelost. Steriel-filter door middel van een spuit met een 0,2-µm poriegrootte, aliquoot Filtreer de oplossing in 50 mL buizen en bewaren bij -20 ° C. Tris buffer (pH 7.4) voor de Tris buffer, het zout en de oplossingen die zijn vermeld in tabel 4 combineren en toevoegen van ddH 2 O tot 100 mL. Steriel-filter door middel van een spuit Filtreer met een poriegrootte van 0,2 µm en een aliquoot deel van de oplossing in 50 mL tubes; bewaren bij kamertemperatuur. Vet lichamelijk kweekmedium ter voorbereiding van de voedingsbodem van vet lichamelijk, bereiden alle oplossingen hierboven vermelde. Combineren ze volgens de volumes in tabel 5 te maken vet lichamelijk kweekmedium 200 mL. Breng de pH op 7,2 met NaOH of HCl. Steriel-filter de oplossing met behulp van een spuit-filter met een poriegrootte 0.2-µm. De oplossing in 15 mL aliquots verdelen en opslaan bij-20 ° C voor maximaal 6 maanden. 2. Voorbereiden van de dissectie een stereomicroscoop (10-20 x vergroting) met verlichting voor te bereiden en lay-out twee ultra-fijne pincet en een paar micro dissectie schaar. Bereiden alle oplossingen nodig zijn voor het experiment. Het vet lichamelijk kweekmedium op kamertemperatuur ontdooien. Opmerking: Neerslagmiddelen kunnen worden ontbonden door zachtjes verwarming de oplossing niet hoger dan 30 ° C. Met een aspirator, volwassen vrouwelijke muggen (3-7 dagen na opkomst) verzamelen en anesthetize hen met behulp van kooldioxide of ice. Opmerking: Eenmaal verdoofd, de muggen moeten worden gehouden onder CO 2 zo spoedig mogelijk, niet meer dan 20 min. als alternatief, de muggen worden verdoofd op ijs en gedurende ongeveer 30 min. Bereiden een 6-well plaat met APS 3 mL per putje. 3. Vet lichamelijk dissectie concentreren het ontleden stereomicroscoop en aanpassen van de stoel op een comfortabele hoogte. Plaats een concave microscoopglaasje op het oppervlak van de Microscoop en Voeg twee druppels van APS naar het midden. Een mug halen door een been met behulp van een pincet en het overbrengen van de APS-oppervlak op het microscoopglaasje. Zorgvuldig greep de mug door de thorax, met de pincet in de linkerhand, en draaien van de mug, zodat de ventrale zijde naar boven is. Terwijl het lichaam gestaag door de thorax, pak de laatste twee abdominale segmenten, met de pincet in de rechterhand, en trek voorzichtig. Opmerking: De laatste twee abdominale segmenten zal scheiden van de buik en de bijgevoegde eierstokken, Malpighian tubuli methaanproductie en middendarm; Soms zal het gewas schuif uit de buik. Als ze niet zijn verwijderd, steek de gesloten tips van de verlostang in de kleine opening gemaakt en verwijdert u de resterende weefsels. De juiste verlostang gereserveerd en de lente schaar halen. Schuif een mes in het gat in de buik tot het segment onder de thorax. Zacht en snel de buik in de lengte gesneden. Opmerking: Zodra de cut is geboekt, de buik moet gaan om uit te breiden naar buiten, hoewel dit niet onmiddellijk kan optreden. Gaat u verder met de tweede cut, die zal worden een laterale snede onder de thorax en iets minder dan waar de eerste snede eindigde. Opmerking: De buik moet dan openstellen en distantiëren van de thorax, met de cuticle omhoog en de organen van de vet kant-ondergedompeld in de jaarlijkse beleidsstrategie. Deze buikwand lichaam is de lichaam vet voorbereiding voor in vitro cultuur. Til de vet-instanties van de APS-oplossing uit met het topje van een paar pincet en overbrengen van de oplossing naar de 6-well plaat met APS bij kamertemperatuur. Toestaan van het weefsel tot rust gedurende ongeveer 0.5 uur alvorens door te gaan naar de cultuur van vet lichamelijk. 4. Vet lichamelijk cultuur Incubeer de vet organen op APS bij kamertemperatuur gedurende ten minste 0.5 uur aan hen equilibreer. Overbrengen van de organen van vet met behulp van het uiteinde van de verlostang en zachtjes hen bevrijden van de APS-oplossing. Het puntje lager in het vet lichamelijk kweekmedium. Opmerking: Het lichaam vet moet openen op het oppervlak van het medium en vrij zweven. De cultuur van vet lichamelijk worden doorgaans uitgevoerd in 96-wells-platen, met 150-200 µL van medium in elk putje. Een goed past maximaal drie individuele organen van vet, en ze zijn levensvatbaar is voor meer dan 12 h (ongepubliceerde persoonlijke resultaten). Na de incubatieperiode, breng de vet-organen van het medium in 1.5-mL centrifuge buizen met de juiste reagentia voor downstream processing. Opmerking: Typische analyses omvatten qPCR 16 , 17 , 18 , 19, Western blotting 18 , 20, transcriptomics 26, proteomics 21 of metabolomica 22.

Representative Results

Als voorbeeld, we voerde een experiment van vet lichamelijk cultuur en geïsoleerde vet instanties gestimuleerd door ze aan het broeden op een oplossing die een evenwichtig mengsel van alle twintig natuurlijk voorkomende aminozuren en de insecten steroïde hormoon 20-hydroxy ecdysone (10 µM) voor 6 h . Als een besturingselement werden vet organen geïncubeerd op APS voor een gelijke hoeveelheid tijd. Na incubatie werd het totale RNA geïsoleerd met behulp van een tri-reagens27 volgens de instructies van de fabrikant. De kwaliteit en kwantiteit van uitgepakte RNA monsters werden beoordeeld met een spectrofotometer, fluorimetrische kwantificatie en agarose gelelektroforese. RNA sequencing bibliotheken werden gegenereerd met behulp van 4 µg totaal RNA en werden gekwantificeerd aan de hand van twee verschillende technieken. Vervolgens werden de bibliotheken voor gepaarde einde-sequencing gestuurd naar een commerciële provider. De resultaten van dit experiment worden weergegeven in tabel 6. Genen tonen de sterkste transcriptionele reactie op aminozuur en 20-hydroxyecdysone waren voornamelijk de eidooier eiwit genen, die is in overeenstemming met de eerdere resultaten11. Figuur 1 toont een warmte-kaart met vermelding van de niveaus van gen expressie van 1,256 differentieel uitgedrukt genen van gekweekte vet organen na twee verschillende behandelingen. Figuur 1 . Warmte kaart van genen uitgedrukt in de cultuur van vet lichamelijk. De warmte-kaart was berekend op basis van het aantal specifieke afschriften voor elk gen in de verschillende bibliotheken met behulp van de heatmap pakket28 die deel uitmaakt van de R-Softwareomgeving. De donkerdere tint stelt hogere genexpressie. 1,256 genen met statistisch significante variatie in expressie (Q-waarden < 0.05) worden weergegeven. De genen worden gerangschikt volgens hun gemiddelde expressie niveau, aangegeven door de dendrogram aan de linkerkant (niet volgens hun verwantschappen). Let op het hoge aantal genen met up – of down-gereglementeerde expressie na stimulatie met aminozuren (AA) en 20-hydroxyecdysone (20E). APS = Aedes fysiologische zoutoplossing. Zie aanvullende bestand 1 voor een lijst van genen en hun relatieve expressie niveaus. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Aminozuur Moleculair gewicht g/mol mM concentratie mg / Liter mg voor 300 mL volume Alanine 89.1 26.68 2377.19 713.16 Arginine 174,2 26.68 4647.66 1394.3 Asparagine 150.1 26.68 4004.67 1201.4 Asparaginezuur 133 26.68 3548.44 1064.53 Cysteïne 121.16 10.68 1293.99 388.2 Glutaminezuur 147.1 26.68 3924.63 1177.39 Glutamine 146 26.68 3895.28 1168.58 Glycine 75 53.32 3999 1199.7 Histidine 155.16 80 12412.8 3723.84 Isoleucine 131 10.68 1399.08 419.72 Lycine 183 26.68 4882.44 1464.73 Leucine 131 26.68 3495.08 1048.52 Fenylalanine 165 10.68 1762.2 528.66 Proline 115 26.68 3068.2 920.46 Serine 105 53.32 5598.6 1679.58 Threonine 119 10.68 1270.92 381.28 Tryptofaan 204 10.68 2178.72 653.62 Tyrosine 181 5.32 962.92 288.88 Valine 117 10.68 1249.56 374.87 Methionine 149 10.68 1591.32 477.4 Tabel 1. 4 x aminozuur stamoplossing. Component Gewicht in gram toegevoegd aan 50 ml ddH2O NaCl 8,0 g KCl 0.074 g MgCl2-6 H2O 0.120 g NaHCO3 0.0250 g Tabel 2. 20 X zout stamoplossing. Component Gewicht in gram toegevoegd aan 100 ml ddH2O CaCl2-2 H2O 0,90 g g > tabel 3. 50 x calcium stamoplossing. Component Concentratie van de stockoplossing Volume materieel voor 100 ml buffer Tris pH8.0 1 M 5 mL EDTA 0,25 M 2 mL NaCl NB 0,3 g ddH2O NB tot 100 mL (~ 93 mL) Tabel 4. Tris buffer. Component Volume materieel voor 200 ml Aminozuur-stockoplossing 150 mL Zout-stockoplossing 10 mL Calcium-stockoplossing 4 mL TES Buffer 10 mL ddH2O 26 mL Tabel 5. Vet lichamelijk kweekmedium. Aantekening Beschrijving van het gen Vouw wijzigen P-waarde AAEL006138 Vitellogenin-B 3443 2.52E-112 AAEL006126 Vitellogenin-C 2795 8.64E-91 AAEL006563 vitellogenic carboxypeptidase 1002 2.17E-119 AAEL010434 Vitellogenin-A 220 1.14E-27 AAEL006542 vitellogenic carboxypeptidase 185 2.14E-65 AAEL012678 AAEL003006-PA [Aedes aegypti](65%) 96 4.00E-70 AAEL000080 hypothetische eiwit 82 6.69E-188 AAEL015312 Vitellogenic cathepsin B 77 1.27E-15 AAEL009588 nucleaire receptor 3 75 4.58E-56 AAEL010529 hypothetische eiwit 66 1.32E-29 Tabel 6. Experimentele resultaten. Aanvullende bestand 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Insect orgel cultuur was veel gebruikt voor het bestuderen van insecten Endocrinologie, ontwikkeling en stofwisseling, evenals over het onderzoeken van de wisselwerking tussen bepaalde organen en bacteriële symbionten29,30,31, 32,33,34. In vitro vet lichamelijk orgel cultuur gewend was specifiek aminozuur vervoer en de regulering van de productie van de eiwitten van de dooier in de muggen en andere Diptera16,17,35 , 36. tijdens het proces van vitellogenesis, de mug vet lichamelijk worden met een matrix van hoge-specificiteit aminozuur vervoerders bloedmeel afkomstige aminozuren uit de Hemolymfe voor het synthetiseren van grote hoeveelheden dooier eiwitten12 importeren ,19,35,,36. Vet lichamelijk cultuur speelde aan de afbakening van de voedingsbehoeften van vet lichamelijk in deze context18.

De kwaliteit van de grondstof, vrouwelijke muggen, is essentieel voor het succes van deze experimenten. Muggenlarven groeide op in onder-overvolle voorwaarden en gevoed op hoge-nutriënt diëten meestal produceren de beste resultaten. Er zijn enkele belangrijke variabelen te overwegen bij de vaststelling van vet lichamelijk kweekomstandigheden van de mug in het laboratorium in termen van experimentele ontwerp. We toonden in eerdere studies dat vet lichamelijk genexpressie aanzienlijk afhankelijk van de persoonlijke levensgeschiedenis en de voedingstoestand van de mug11,22 varieert. De mug kweekomstandigheden moet uniform om de variabiliteit in de grootte en nutritionele reserves van de experimentele muggen. Bovendien moeten personeel uitvoeren de ontledingen worden opgeleid om te zorgen voor snelle en accurate dissecties met consistente resultaten. Levensvatbaarheid van de cellen in geïsoleerde vet organen kan worden gecontroleerd met behulp van verschillende kleuring methoden37,38.

De proefopzet van een vet lichamelijk cultuur experiment moet rekening houden met het aantal dissecties mogelijk in een bepaalde periode. Wanneer grote hoeveelheden vet organen zijn nodig, meerdere sessies van de dissectie of meerdere dissectors kunnen het nodig zijn. Er is een breed scala van toekomstige toepassingen voor in vitro vet lichamelijk cultuur in muggen en andere insecten. Het is met name handig voor het testen van potentiële drugkandidaten voor insectenbestrijding. Het gebruik van transgene technieken bij insecten uitspreken specifieke verslaggever eiwitten in vet lichamelijk trophocytes zal openstellen van nieuwe methoden voor het ontwikkelen van krachtige bioassays voor de studie van vet lichamelijk fysiologie.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit onderzoek werd gesteund door de NIH-subsidie #SC1AI109055, de 2014 NMSU HHMI grant #52008103, en NSF PGR verlenen #1238731. Wij danken de deelnemers van de NMSU voorjaar 2015 BIOL302 moleculaire methoden klasse en Lavesh Bhatia voor hun technische ondersteuning met de vet lichamelijk cultuur experimenten.

Materials

Scissors  Fiskars 83872
Fly pad Genesee Scientific 789060
Battery-powered aspirator w/ collection vial Hausherrs Machine Works, Inc. 3740-01-210-2368
Fine tip forceps World Precision Instruments, Inc.  500085
Light microscope  Leica Microsystems
96 well plate  Sigma CL S3383
Sucrose Sigma S9378
Alanine Sigma A7627
Arginine Sigma A5006
Asparagine Sigma A0884
Aspartic Acid Sigma A9256
Cysteine Sigma W326305
Glutamic Acid Sigma G1251
Glutamine Sigma G3126
Glycine Sigma G2879
Histidine Sigma H6034
Isoleucine Sigma I2752
Lysine Sigma L5501
Leucine Sigma L8000
Phenylalanine Sigma P2126
Proline Sigma P0380
Serine Sigma S4500
Threonine Sigma T8625
Tryptophan Sigma T0254
Tyrosine Sigma T3754
Valine Sigma V0500
Methionine Sigma M9625
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P9333
MgCl2-6H2O Sigma M2670
NaHCO3 Sigma S5761
CaCl2-2H2O Sigma C8106
Tris pH8.0  Sigma T1503
EDTA Sigma E6758
ddH2O Sigma W4502
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benelli, G., Mehlhorn, H. Declining malaria, rising of dengue and Zika virus: insights for mosquito vector control. Parasitol Res. 115 (5), 1747-1754 (2016).
  2. Newby, G., et al. The path to eradication: a progress report on the malaria-eliminating countries. Lancet. 387 (10029), 1775-1784 (2016).
  3. Clements, A. N. . The Biology of Mosquitoes. 2, (1992).
  4. Long, C. A., Zavala, F. Malaria vaccines and human immune responses. Curr Opin Microbiol. 32, 96-102 (2016).
  5. Mendis, K. N., David, P. H., Carter, R. Human immune responses against sexual stages of malaria parasites: considerations for malaria vaccines. Int J Parasitol. 20 (4), 497-502 (1990).
  6. Frings, S., Lindemann, B. Odorant response of isolated olfactory receptor cells is blocked by amiloride. J Membr Biol. 105 (3), 233-243 (1988).
  7. Froese, A., Szyszka, P., Menzel, R. Effect of GABAergic inhibition on odorant concentration coding in mushroom body intrinsic neurons of the honeybee. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 183-195 (2014).
  8. Yewhalaw, D., et al. Multiple insecticide resistance: an impediment to insecticide-based malaria vector control program. PLoS One. 6 (1), e16066 (2011).
  9. Arrese, E. L., Soulages, J. L. Insect fat body: energy, metabolism, and regulation. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2010).
  10. Raikhel, A. S., Deitsch, K. W., Sappington, T. W., Crampton, J. M., Beard, C. B., Louis, C. . The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A Methods Manual. , 507-522 (1997).
  11. Price, D. P., et al. The fat body transcriptomes of the yellow fever mosquito Aedes aegypti, pre- and post- blood meal. PLoS One. 6 (7), e22573 (2011).
  12. Hansen, I. A., Attardo, G. M., Rodriguez, S. D., Drake, L. L. Four-way regulation of mosquito yolk protein precursor genes by juvenile hormone-, ecdysone-, nutrient-, and insulin-like peptide signaling pathways. Front Physiol. 5, 103 (2014).
  13. Raikhel, A. S., Dhadialla, T. S. Accumulation of yolk proteins in insect oocytes. Annu Rev Entomol. 37, 217-251 (1992).
  14. Raikhel, A. S., et al. Molecular biology of mosquito vitellogenesis: from basic studies to genetic engineering of antipathogen immunity. Insect Biochem Mol Biol. 32 (10), 1275-1286 (2002).
  15. Hansen, I. A., Attardo, G. M., Chandrasekar, R. Ch. 6. Short Views on Insect Molecular Biology. , (2009).
  16. Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (29), 10626-10631 (2004).
  17. Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito. J Biol Chem. 280 (21), 20565-20572 (2005).
  18. Attardo, G. M., Hansen, I. A., Shiao, S. H., Raikhel, A. S. Identification of two cationic amino acid transporters required for nutritional signaling during mosquito reproduction. J Exp Biol. 209 (Pt 16), 3071-3078 (2006).
  19. Carpenter, V. K., et al. SLC7 amino acid transporters of the yellow fever mosquito Aedes aegypti and their role in fat body TOR signaling and reproduction. J Insect Physiol. 58 (4), 513-522 (2012).
  20. Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (23), 13374-13379 (2003).
  21. Hugo, L. E., et al. Proteomic biomarkers for ageing the mosquito Aedes aegypti to determine risk of pathogen transmission. PLoS One. 8 (3), e58656 (2013).
  22. Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasit Vectors. 8, 252 (2015).
  23. Uchida, K., et al. Induction of oogenesis in mosquitoes (Diptera: Culicidae) by infusion of the hemocoel with amino acids. J Med Entomol. 38 (4), 572-575 (2001).
  24. Uchida, K., Ohmori, D., Yamakura, F., Suzuki, K. Changes in free amino acid concentration in the hemolymph of the female Culex pipiens pallens (Diptera: Culicidae), after a blood meal. J Med Entomol. 27 (3), 302-308 (1990).
  25. Hayes, E. Determination of a physiological saline solution for Aedes aegypti .(L). J Econ Entomol. 46 (4), 624-627 (1953).
  26. Price, D. P., et al. The Fat Body Transcriptomes of the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti, Pre- and Post Blood Meal. Plos One. 6 (7), e22573 (2011).
  27. Chomczynski, P., Mackey, K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide-and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 19 (6), 942-945 (1995).
  28. Fujiwara, T., Kazawa, T., Haupt, S. S., Kanzaki, R. Postsynaptic odorant concentration dependent inhibition controls temporal properties of spike responses of projection neurons in the moth antennal lobe. PLoS One. 9 (2), e89132 (2014).
  29. Larsen, W. P. Growth in an insect organ culture. J Insect Physiol. 13 (4), 613-619 (1967).
  30. Judy, K. J., et al. Isolation, Structure, and Absolute Configuration of a New Natural Insect Juvenile Hormone from Manduca sexta. Proc Natl Acad Sci USA. 70 (5), 1509-1513 (1973).
  31. Marks, E. P. The action of hormones in insect cell and organ cultures. Gen Comp Endocrinol. 15 (2), 289-302 (1970).
  32. Hughes, G. L., Pike, A. D., Xue, P., Rasgon, J. L. Invasion of Wolbachia into Anopheles and Other Insect Germlines in an Ex vivo Organ Culture System. PLoS One. 7 (4), e36277 (2012).
  33. Postlethwait, J. H., Handler, A. M. Roles of Juvenile-Hormone and 20-Hydroxy-Ecdysone during Vitellogenesis in Isolated Abdomens of Drosophila melanogaster. J Insect Physiol. 25 (5), 455-460 (1979).
  34. Spielman, A., Gwadz, R. W., Anderson, W. A. Ecdysone-initiated ovarian development in mosquitoes. J Insect Physiol. 17 (10), 1807-1814 (1971).
  35. Boudko, D. Y., et al. Substrate specificity and transport mechanism of amino-acid transceptor Slimfast from Aedes aegypti. Nat Commun. 6, 8546 (2015).
  36. Fleischer, J., Bumbalo, R., Bautze, V., Strotmann, J., Breer, H. Expression of odorant receptor Olfr78 in enteroendocrine cells of the colon. Cell Tissue Res. 361 (3), 697-710 (2015).
  37. Jones, K. H., Senft, J. A. An improved method to determine cell viability by simultaneous staining with fluorescein diacetate-propidium iodide. J Histochem Cytochem. 33 (1), 77-79 (1985).
  38. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. A3B, (2001).

Tags

Fat BodyOrgan CultureAedes AegyptiVectorZika VirusMosquito PhysiologyYolk Protein ProductionNutrient UptakeIn VitroNext-generation SequencingEcdysoneAmino AcidPhysiological SalineDissection

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Chung, H., Rodriguez, S. D., Carpenter, V. K., Vulcan, J., Bailey, C. D., Nageswara-Rao, M., Li, Y., Attardo, G. M., Hansen, I. A. Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus. J. Vis. Exp. (126), e55508, doi:10.3791/55508 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image