الجسم الدهون نظام الثقافة الجهاز في بعوض الزاعجة المصرية، ناقل للفيروس Zika
Summary
الجسم الدهون هو الجهاز المركزي الأيضي في الحشرات. نقدم نظام جهاز يعيش ثقافة التي تمكن المستخدم من دراسة ردود أنسجة الجسم الدهون منعزلة للمنبهات المختلفة.
Abstract
الجسم الدهون الحشرات يلعب دوراً مركزياً في الأيض الحشرات وتخزين المواد الغذائية، النسخ المتطابق لوظائف الكبد والأنسجة الدهنية في الفقاريات. عادة ما يتم توزيع أنسجة الجسم الدهون الحشرات في جميع أنحاء الجسم الحشرات. ومع ذلك، غالباً ما تتركز في البطن وتعلق على هيئة جدار البطن.
الجسم الدهون البعوض هو المصدر الوحيد لصفار البيض والبروتينات، والتي تعتبر حاسمة بالنسبة لإنتاج البيض. ولذلك، يمثل ثقافة أنسجة الجسم الدهون البعوض في المختبر نظاما هاما لدراسة فسيولوجيا البعوض، التمثيل الغذائي، وفي نهاية المطاف، إنتاج البيض. وتبدأ عملية الثقافة الدهون الجسم بإعداد الحلول والمواد الكاشفة، بما في ذلك حلول الأسهم من الأحماض الأمينية و بعوض المحلول الملحي الفسيولوجي الملح حل الأسهم (الجزائرية) وحل مخزون الكالسيوم والجسم الدهون الثقافة المتوسطة. ما زالت العملية مع تشريح الجسم الدهون، متبوعاً علاج تجريبي. وبعد العلاج، ويمكن أن يؤديها مجموعة متنوعة من تحليلات مختلفة، بما في ذلك الحمض النووي الريبي التسلسل (الحمض النووي الريبي-Seq)، قبكر والبقع الغربية، البروتيوميات وجميع.
في تجربتنا مثال، نبدي البروتوكول عن طريق الختان والثقافة الهيئات الدهون من البعوض الحمى الصفراء، بعوض الزاعجة المصرية، ناقل الرئيسي من سيتناقش بما في ذلك حمى الضنك وداء شيكونغونيا وزكى. الجيش الملكي النيبالي من الهيئات الدهون مثقف تحت شرط فسيولوجية المعروفة لبروتينات صفار upregulate مقابل السيطرة تخضع لتحليل الحمض النووي الريبي Seq لإثبات الفائدة المحتملة لهذا الإجراء لإجراء تحقيقات تعبير الجيني.
Introduction
البعوض ناقلات الأمراض البشرية المدمرة، بما في ذلك الملاريا وحمى الضنك وداء شيكونغونيا و Zika1،،من23. وعلى الرغم من الجهود الدولية المكثفة للحد من هذه الأمراض ومراقبة السكان البعوض يحيل بها المرض، انتشار الأوبئة للأمراض التي ينقلها البعوض لا تزال شائعة، لا سيما في البلدان النامية. لقاحات فعالة ضد العديد من هذه الأمراض أما غير متوفرة أو لفعالية محدودة4،5. الطريقة الأكثر فعالية للحيلولة دون تفشي السيطرة على البعوض السكان، أساسا من خلال استخدام المبيدات الحشرية العلاجات. ومع ذلك، وضعت في العديد من البعوض السكان مقاومة المبيدات الحشرية وأصبحت مشكلة شائعة في جميع أنحاء العالم6،،من78. دراسة علم وظائف الأعضاء البعوض أمر ضروري لتطوير أدوات جديدة واستراتيجيات السيطرة على المرض.
الجسم الدهون البعوض يلعب دوراً مركزياً في تخزين المواد الغذائية والتوازن الأيضي، والاستنساخ، وتقويض إكسينوبيوتيك9،10،،من1112. هو جهاز التخزين الرئيسي للشحوم، والجليكوجين، والأحماض الأمينية في شكل بروتينات التخزين. وهو يعمل أيضا كموقع التوليف لمعظم البروتينات hemolymph ونواتج الأيض. في البعوض، والجسد الدهون هو المصدر الوحيد لإنتاج البروتين الصفار الذي يحدث في الإناث بعد أن تأخذ وجبة الدم13،14.
نوع الخلايا الرئيسية للجسم الدهون هو تروفوسيتي كبير، الكروموزومية أو adipocyte3،9،،من1012. ينقسم إلى الفصوص أو مانعات أنسجة الجسم الدهون ويمكن العثور عليها في جميع أجزاء الجسم من البعوض، مع الجزء الأكبر يقع في البطن، حيث يتم إرفاق الفصوص كبيرة من الدهون في الجسم على هيئة جدار البطن.
النظام ثقافة الجسم الدهون البعوض المعروضة هنا وضعت في السبعينات وما زالت أداة قوية لدراسة الجسم الدهون علم وظائف الأعضاء10، لا سيما في تركيبة مع تحليل التكنولوجيات الحالية. ويستند أساسا لهذا الأسلوب عزل جدران الجسم البطن والأنسجة المرتبطة بها الدهون في الجسم. طبيعة بشرة البطن مسعور يتسبب في أن تطفو على سطح متوسط الثقافة، مع الفصوص المرفقة من البطن الدهون الجسم مغمورة. يتم الحفاظ على سبيراكليس وهيكل تراتشيولار، تأمين الأوكسجين للأنسجة المستزرعة. من الآن فصاعدا، سوف نشير إلى هذه الأعمال التحضيرية باعتبارها “هيئات الدهون.” الهيئات الدهون منعزلة البقاء لأكثر من 12 ح عند المحتضنة في الوسيلة المناسبة (نتائج غير منشورة). الثقافة الدهون في الجسم هو أداة قيمة وقد تناول مجموعة متنوعة من الأسئلة المتعلقة بالدهون الجسم الغدد الصماء وعلم وظائف الأعضاء9،10،،من1215،16، 17.
مثقف الدهون الهيئات يمكن أن تخضع لمختلف التجارب والتحكم في العلاجات، توقيت التي يمكن أن يقررها المحقق. في نهاية فترة الحضانة، يمكن جمع الهيئات الدهون ومعالجته لتحليلات المتلقين للمعلومات، بما في ذلك قبكر16،17،،من1819، الغربية النشاف18 ،20، البروتيوميات21أو22من جميع. يمكن إجراء تجارب على نطاقات مختلفة، من الهيئات الدهون الفردية لمجموعات من مئات التي يمكن أن تكون مثقف معا.
نتائج تمثيلية شملت هنا مستمدة من الدهون الهيئات مثقف حضور الأحماض الأمينية و ecdysone 20-هيدروكسي هرمون الستيرويد لمحاكاة التنشيط وجبة الدم من، فيتيلوجينيسيس،من1617 ،من 2324. يمكننا تحليل ومقارنة التعبير الجيني التفاضلي لعدم تنشيط مقابل تنشيط الهيئات الدهون عن طريق تحليل تسلسل الجيل القادم.
Protocol
Representative Results
Discussion
الثقافة الحشرات الجهاز كان يستخدم على نطاق واسع دراسة الحشرات علم الغدد الصماء، والتنمية، والايض، فضلا عن التحقيق في التفاعل بين أجهزة محددة والبكتيرية سيمبيونتس29،،من3031، 32،،من3334. واستخدمت في المختبر الجسم الدهون جهاز الثقافة تحديداً لدراسة النقل من الأحماض الأمينية وتنظيم إنتاج البروتين صفار في البعوض وغيرها17،16، ديبتيرا35 , 36-أثناء عملية فيتيلوجينيسيس، يستخدم الجسم الدهون البعوض صفيف الناقلين الأحماض الأمينية خصوصية عالية لاستيراد الأحماض الأمينية المستمدة من وجبة الدم من هيموليمف لتجميع كميات كبيرة من بروتينات صفار12 ،19،،من3536. ثقافة الجسم الدهون كانت مفيدة لتحديد المتطلبات الغذائية الجسم الدهون في هذا السياق18.
نوعية المواد البداية، أنثى البعوض، أمر حاسم لنجاح هذه التجارب. يرقات البعوض التي أثيرت في ظروف مزدحمة تحت وتتغذى على الوجبات الغذائية العالية في المغذيات وعادة ما ينتج أفضل النتائج. وهناك بعض المتغيرات الهامة في الاعتبار عند وضع شروط ثقافة الجسم الدهون البعوض في المختبر من حيث التصميم التجريبي. أظهرنا في دراسات سابقة أن التعبير الجيني الجسم الدهون تتفاوت تفاوتاً كبيرا تبعاً لتاريخ حياة الفرد والحالة التغذوية ل البعوض11،22. يجب أن تكون شروط الثقافة البعوض موحدة للحد من التفاوت في الحجم والاحتياطيات الغذائية للبعوض التجريبية. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي تدريب الموظفين يؤدون تشريح لضمان تشريح سريعة ودقيقة مع نتائج متسقة. يمكن التحقق من صلاحية خلية في هيئات الدهون منعزلة باستخدام مختلف الأساليب المصبوغة37،38.
تصميم تجريبي لتجربة ثقافة الجسم الدهون ينبغي أن تأخذ في الاعتبار عدد تشريح ممكن في فترة زمنية معينة. عندما يتطلب الأمر كميات كبيرة من الدهون في الهيئات، دورات تشريح متعددة أو dissectors متعددة قد يكون ضروريا. وهناك طائفة واسعة من التطبيقات المستقبلية للثقافة في المختبر الجسم الدهون في البعوض وغيرها من الحشرات. أنه سوف يكون مفيداً بشكل خاص لاختبار المرشحين المحتملين من المخدرات لمكافحة الحشرات. استخدام التقنيات المعدلة وراثيا في الحشرات للتعبير عن البروتينات مراسل محددة في الجسم الدهون تروفوسيتيس سوف تفتح طرق جديدة لتطوير المقايسة قوية لدراسة فسيولوجيا الجسم الدهون.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث المعاهد الوطنية للصحة منحة #SC1AI109055، منح NMSU HHMI #52008103 2014، وجبهة الخلاص الوطني مكتب المدعي العام الاتحادي منح #1238731. ونحن نشكر المشاركين في فئة NMSU ربيع عام 2015 BIOL302 الأساليب الجزيئية ولافيش باتيا على دعمها التقني مع تجارب الثقافة الجسم الدهون.
Materials
| Scissors | Fiskars | 83872 | |
| Fly pad | Genesee Scientific | 789060 | |
| Battery-powered aspirator w/ collection vial | Hausherrs Machine Works, Inc. | 3740-01-210-2368 | |
| Fine tip forceps | World Precision Instruments, Inc. | 500085 | |
| Light microscope | Leica Microsystems | ||
| 96 well plate | Sigma | CL S3383 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Alanine | Sigma | A7627 | |
| Arginine | Sigma | A5006 | |
| Asparagine | Sigma | A0884 | |
| Aspartic Acid | Sigma | A9256 | |
| Cysteine | Sigma | W326305 | |
| Glutamic Acid | Sigma | G1251 | |
| Glutamine | Sigma | G3126 | |
| Glycine | Sigma | G2879 | |
| Histidine | Sigma | H6034 | |
| Isoleucine | Sigma | I2752 | |
| Lysine | Sigma | L5501 | |
| Leucine | Sigma | L8000 | |
| Phenylalanine | Sigma | P2126 | |
| Proline | Sigma | P0380 | |
| Serine | Sigma | S4500 | |
| Threonine | Sigma | T8625 | |
| Tryptophan | Sigma | T0254 | |
| Tyrosine | Sigma | T3754 | |
| Valine | Sigma | V0500 | |
| Methionine | Sigma | M9625 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2-6H2O | Sigma | M2670 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| CaCl2-2H2O | Sigma | C8106 | |
| Tris pH8.0 | Sigma | T1503 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| ddH2O | Sigma | W4502 |
References
- Benelli, G., Mehlhorn, H. Declining malaria, rising of dengue and Zika virus: insights for mosquito vector control. Parasitol Res. 115 (5), 1747-1754 (2016).
- Newby, G., et al. The path to eradication: a progress report on the malaria-eliminating countries. Lancet. 387 (10029), 1775-1784 (2016).
- Clements, A. N. . The Biology of Mosquitoes. 2, (1992).
- Long, C. A., Zavala, F. Malaria vaccines and human immune responses. Curr Opin Microbiol. 32, 96-102 (2016).
- Mendis, K. N., David, P. H., Carter, R. Human immune responses against sexual stages of malaria parasites: considerations for malaria vaccines. Int J Parasitol. 20 (4), 497-502 (1990).
- Frings, S., Lindemann, B. Odorant response of isolated olfactory receptor cells is blocked by amiloride. J Membr Biol. 105 (3), 233-243 (1988).
- Froese, A., Szyszka, P., Menzel, R. Effect of GABAergic inhibition on odorant concentration coding in mushroom body intrinsic neurons of the honeybee. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 183-195 (2014).
- Yewhalaw, D., et al. Multiple insecticide resistance: an impediment to insecticide-based malaria vector control program. PLoS One. 6 (1), e16066 (2011).
- Arrese, E. L., Soulages, J. L. Insect fat body: energy, metabolism, and regulation. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2010).
- Raikhel, A. S., Deitsch, K. W., Sappington, T. W., Crampton, J. M., Beard, C. B., Louis, C. . The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A Methods Manual. , 507-522 (1997).
- Price, D. P., et al. The fat body transcriptomes of the yellow fever mosquito Aedes aegypti, pre- and post- blood meal. PLoS One. 6 (7), e22573 (2011).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Rodriguez, S. D., Drake, L. L. Four-way regulation of mosquito yolk protein precursor genes by juvenile hormone-, ecdysone-, nutrient-, and insulin-like peptide signaling pathways. Front Physiol. 5, 103 (2014).
- Raikhel, A. S., Dhadialla, T. S. Accumulation of yolk proteins in insect oocytes. Annu Rev Entomol. 37, 217-251 (1992).
- Raikhel, A. S., et al. Molecular biology of mosquito vitellogenesis: from basic studies to genetic engineering of antipathogen immunity. Insect Biochem Mol Biol. 32 (10), 1275-1286 (2002).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Chandrasekar, R. Ch. 6. Short Views on Insect Molecular Biology. , (2009).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (29), 10626-10631 (2004).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito. J Biol Chem. 280 (21), 20565-20572 (2005).
- Attardo, G. M., Hansen, I. A., Shiao, S. H., Raikhel, A. S. Identification of two cationic amino acid transporters required for nutritional signaling during mosquito reproduction. J Exp Biol. 209 (Pt 16), 3071-3078 (2006).
- Carpenter, V. K., et al. SLC7 amino acid transporters of the yellow fever mosquito Aedes aegypti and their role in fat body TOR signaling and reproduction. J Insect Physiol. 58 (4), 513-522 (2012).
- Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (23), 13374-13379 (2003).
- Hugo, L. E., et al. Proteomic biomarkers for ageing the mosquito Aedes aegypti to determine risk of pathogen transmission. PLoS One. 8 (3), e58656 (2013).
- Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasit Vectors. 8, 252 (2015).
- Uchida, K., et al. Induction of oogenesis in mosquitoes (Diptera: Culicidae) by infusion of the hemocoel with amino acids. J Med Entomol. 38 (4), 572-575 (2001).
- Uchida, K., Ohmori, D., Yamakura, F., Suzuki, K. Changes in free amino acid concentration in the hemolymph of the female Culex pipiens pallens (Diptera: Culicidae), after a blood meal. J Med Entomol. 27 (3), 302-308 (1990).
- Hayes, E. Determination of a physiological saline solution for Aedes aegypti .(L). J Econ Entomol. 46 (4), 624-627 (1953).
- Price, D. P., et al. The Fat Body Transcriptomes of the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti, Pre- and Post Blood Meal. Plos One. 6 (7), e22573 (2011).
- Chomczynski, P., Mackey, K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide-and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 19 (6), 942-945 (1995).
- Fujiwara, T., Kazawa, T., Haupt, S. S., Kanzaki, R. Postsynaptic odorant concentration dependent inhibition controls temporal properties of spike responses of projection neurons in the moth antennal lobe. PLoS One. 9 (2), e89132 (2014).
- Larsen, W. P. Growth in an insect organ culture. J Insect Physiol. 13 (4), 613-619 (1967).
- Judy, K. J., et al. Isolation, Structure, and Absolute Configuration of a New Natural Insect Juvenile Hormone from Manduca sexta. Proc Natl Acad Sci USA. 70 (5), 1509-1513 (1973).
- Marks, E. P. The action of hormones in insect cell and organ cultures. Gen Comp Endocrinol. 15 (2), 289-302 (1970).
- Hughes, G. L., Pike, A. D., Xue, P., Rasgon, J. L. Invasion of Wolbachia into Anopheles and Other Insect Germlines in an Ex vivo Organ Culture System. PLoS One. 7 (4), e36277 (2012).
- Postlethwait, J. H., Handler, A. M. Roles of Juvenile-Hormone and 20-Hydroxy-Ecdysone during Vitellogenesis in Isolated Abdomens of Drosophila melanogaster. J Insect Physiol. 25 (5), 455-460 (1979).
- Spielman, A., Gwadz, R. W., Anderson, W. A. Ecdysone-initiated ovarian development in mosquitoes. J Insect Physiol. 17 (10), 1807-1814 (1971).
- Boudko, D. Y., et al. Substrate specificity and transport mechanism of amino-acid transceptor Slimfast from Aedes aegypti. Nat Commun. 6, 8546 (2015).
- Fleischer, J., Bumbalo, R., Bautze, V., Strotmann, J., Breer, H. Expression of odorant receptor Olfr78 in enteroendocrine cells of the colon. Cell Tissue Res. 361 (3), 697-710 (2015).
- Jones, K. H., Senft, J. A. An improved method to determine cell viability by simultaneous staining with fluorescein diacetate-propidium iodide. J Histochem Cytochem. 33 (1), 77-79 (1985).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. A3B, (2001).
